HCV E2与CD81结合对Raji细胞调节及干扰素α对人肝癌细胞信号转导途径的影响

摘要

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是有包膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科。HCV基因组长约9.6 kb，有一个开放阅读框架，编码的多聚蛋白前体在病毒和宿主蛋白酶的作用下形成结构蛋白(核心蛋白C以及糖基化的包膜蛋白E1、E2)和非结构蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。全世界HCV感染者约1.7亿，感染导致的慢性肝脏疾病是一个严重的全球性的公共卫生难题，目前还没有疫苗上市。HCV两条高度N-糖基化的糖蛋白E1、E2组成病毒体包膜蛋白并形成异二聚体，作为与宿主细胞受体互作的配体。
　　 一、丙型肝炎病毒E2蛋白结合CD81分子对Raji细胞激活的调节
　　 人CD81分子是HCV的细胞表面受体，可结合HCVE2蛋白。事实上HCV假病毒颗粒(HCVpp)，细胞培养的HCV(HCVcc)和所有血浆来源的HCV的感染性均源自与宿主表面CD81等受体分子的结合。CD81分子为四次跨膜素家族成员，有两个胞外环，分布于包括B、T淋巴细胞、NK细胞、肝细胞在内的多种细胞表面，与细胞的活化、增殖、粘附等生物学功能密切相关，尤其对于特异性免疫应答的诱导具有重要作用。在B细胞表面，由CD19-CD21-CD81(TAPA-1)-CD225(Leu-13)共同构成Ⅱ型补体受体复合物，该复合物与B细胞受体(BCR)共同参与B细胞活化的信号传导。B细胞的激活需要BCR以及CD19-CD21-CD81-CD225复合物与抗原的双重结合信号，其中，BCR与抗原分子中的抗原决定簇结合，而CD19-CD21-CD81-CD225复合物则通过CD21与补体C3裂解片段C3d结合(抗原与C3d结合)。HCV E2蛋白与CD81分子的大胞外环结合，改变了B细胞激活的正常信号传导通路，导致B细胞非特异性活化和免疫球蛋白基因的超突变。由于E2蛋白与CD81分子的结合，慢性HCV感染者体内的B细胞大部分为活化的表型，在干扰素治疗应答者，随着血清中HCV RNA水平的降低，外周血中激活的B细胞数量相应显著减少。由于HCV慢性感染与B细胞淋巴瘤及冷球蛋白血症的高度相关性，可以推测这与E2蛋白经CD81分子异常激活B细胞可能有重要关系。HCV E2蛋白与人CD81分子的结合还能非特异性激活T淋巴细胞和下调T细胞表面的T细胞受体，这不利于HCV抗原特异性T细胞免疫应答的诱导，并与慢性HCV感染所致肝组织内大量非HCV抗原特异性T淋巴细胞浸润造成的肝组织炎性损伤密切相关。此外，E2与人CD81分子的结合可抑制NK细胞的活化，抑制HCV感染后的立早期非特异性抗病毒应答。
　　 HCV E2蛋白结合人或者黑猩猩CD81分子可导致B淋巴细胞非特异性激活和免疫球蛋白基因的超突变以及异常免疫球蛋白的大量分泌，显然，这可能与HCV自然感染只能极其有限地诱导中和抗体应答以及天然结构的E2蛋白免疫黑猩猩只能诱导低水平中和抗体应答有重要关系。CD19-CD21-CD81-CD225复合物中，CD21与结合抗原的补体片段C3d结合，使CD19/CD21交联，CD19胞浆区的酪氨酸残基发生磷酸化，起始胞内的信号传递。CD81分子在转录后水平调控CD19分子的表达和在胞膜的定位，CD81分子的交联能引起B细胞的凝集。然而，HCV E2蛋白与CDB1分子结合对B细胞激活、增殖和分化的调控，以及导致特异性抗体应答抑制的分子机制尚不清楚。阐明这些问题，有助于进一步认识和揭示HCV慢性感染以及HCV感染引发B细胞淋巴瘤以及自身免疫性疾病的本质原因。
　　 HCV包膜E2蛋白与CD81分子结合可引起免疫细胞的胞内信号传导通路和细胞免疫功能的异常改变，本研究进一步探讨HCV E2蛋白经CD81分子非特异性激活B细胞和抑制特异性免疫应答的分子机制。HCV E2蛋白和HCVcc与Raji细胞表面CD81结合后触发IκBα的磷酸化，上调抗凋亡Bcl-2家族蛋白，增强对Raji细胞在Fas介导的凋亡中的保护。此外，E2-CD81相互作用可上调CD81和共刺激分子CD80和CD86的表达，下调补体受体CD21。本研究有助于进一步揭示HCV慢性感染以及HCV感染引发B细胞淋巴增生紊乱以及延迟中和抗体出现的分子机制。
　　 1、CD81 RNA干扰和HCV E2质粒的构建及表达
　　 人CD81小干扰RNA(siRNA)表达质粒pGCsi-U6-CD81 siRNA5作为模板进行PCR扩增，获得的siRNA表达体(siRNA expression cassette)被插入慢病毒载体pLenti6。混合质粒共转染HEK293T细胞，前者包括口炎病毒(VSV)糖蛋白表达质粒，HIV gag/pol(pLP1)质粒，HIV rev(pLP2)质粒和含有CD81 siRNA表达体的pLenti6载体。48小时后收集含有慢病毒颗粒的上清，用0.45μm孔径的滤膜过滤。包含CD81siRNA表达体的慢病毒转导至Raji细胞，3天后再同法感染一次，流式细胞术检测细胞表面表达的CD81。
　　 HCV1a型H77株截短型E2蛋白(aa364-661)DNA片段和突变的E2-W529/A(第529位色氨酸被置换成丙氨酸)分别插入pCI-neo质粒。上述两种表达质粒载体转染至293T细胞，72小时后去除上清收集细胞进行裂解，裂解提取物中的重组蛋白用山羊抗E2多克隆抗体检测。
　　 2、E2结合CHO和Raji细胞，E2包被和细胞刺激
　　 人CD81表达质粒和模拟载体分别转染至CHO细胞，48小时后流式细胞术检测表达的CD81及E2蛋白与转染后的CHO、Raji细胞的结合情况。
　　 E2单抗H53用碳酸盐缓冲液稀释至10μg/ml,加至96孔板或24孔板，静置于4℃过夜，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，然后加入足量的RPMI1640完全培养基，37℃孵育30分钟。转染HCVE2表达质粒或模拟载体的293T细胞提取物加至96或24孔板中，37℃孵育60分钟。包被的多孔板进一步用PBS冲洗，将培养于完全培养基中的Raji细胞混匀，加至多孔板，按实验需要进行不同时间段的培养。
　　 3、HCV假病毒颗粒制备和感染
　　 293T细胞共转染编码HCV包膜糖蛋白，gag/pol(pLP1)和rev(pLP2)的表达载体与编码荧光素酶的转移载体。48小时后收集含有HCVpp的上清，用0.45μm孔径的滤膜过滤，以备下一步感染用。其中使用到HCV包膜蛋白表达质粒有1a基因型H77株，1b基因型con-1株和2a基因型J6株。
　　 Huh7.5和Raji细胞作为靶细胞接种至96孔板，浓度为104个细胞/孔，37℃培养。每孔加入上述HCVpp上清50μl，培养5小时后弃上清，细胞用常规培养基在37℃继续培养72小时，弃上清，用PBS冲洗一次，每孔加50μl细胞裂解液进行裂解，然后检测荧光素酶活性。
　　 4、蛋白质印迹法检测
　　 将收集的细胞裂解物煮沸5分钟，用浓度12.5％的含十二烷基磺酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行电泳分离蛋白。将蛋白电转移至硝酸纤维素膜，用不同的一抗、二抗分别处理后，再用增强化学发光法检测其免疫反应性。
　　 二、干扰素α调节人肝癌细胞中MAPK和STAT1信号转导途径
　　 干扰素(IFN)诱导的胞内信号转导过程和其抗病毒效应有关，JAK-STAT通路在IFN诱导的信号转导中起关键作用，IFN与细胞表面的特定受体结合后启动该通路，IFN的抗病毒作用也主要由该通路调节。除了JAK-STAT通路外，其他一些信号转导通路也可能在对IFN的调节过程中发挥重要作用。通过对干扰素α(IFN-α)刺激处理后的人肝癌细胞Huh7和HepG2中的MAPK和STAT1信号转导通路进行检测，我们发现IFN-α可特异上调ERK的磷酸化水平，而对上游激酶MEK的磷酸化似乎无影响。我们同时还检测到p38MAPK磷酸化轻度增加，SAPK/JNK的磷酸化显著增强，下游的ATF-2磷酸化也增强了，这表明IFN-α对MAPK信号转导通路中各级联反应的信号分子有不同程度的上调作用。此外我们还发现IFN-α对STAT1的磷酸化有极大的增强作用，且IFN-α对MAPK信号转导通路的调节在Huh7和HepG2细胞中有所不同。
　　 小结：
　　 1.HCV E2蛋白和HCVcc都可引起IκBα的磷酸化，并上调抗凋亡的Bcl-2家族蛋白的表达，增强Raji细胞对抗Fas-介导的细胞凋亡的能力。此外，这类刺激信号能上调CD81分子和其共刺激分子CD80和CD86，下调补体受体CD21。
　　 2.E2-CD81的结合是引发上述效应的基础，因为在CD81沉默的Raji细胞对E2和HCVcc都不产生反应，且E2突变体E2-W529/A因其不能与CD81结合，对正常Raji细胞也产生不了刺激作用。
　　 3.E2-CD81结合可能是HCV感染导致B细胞淋巴增生紊乱和中和抗体水平低下的原因。
　　 4.IFN-α对MAPK信号转导通路中各级联反应的信号分子有不同程度的上调作用，对STAT1的磷酸化有极大的增强作用，并且对MAPK信号转导通路的调节在Huh7和HepG2细胞中有所不同
　　 5.本研究有助于进一步揭示HCV慢性感染以及HCV感染引发B细胞淋巴增生紊乱以及延迟中和抗体出现的分子机制，有助于进一步理解IFN信号转导通路，为研制有效的HCV疫苗以及开发HCV相关疾病的治疗药物提供一定依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第一部分丙型肝炎病毒E2蛋白结合CD81调节Raji细胞激活、存活和免疫学表型的研究

前 言

1.材料与方法

2.结 果

3.讨 论

参考文献

第二部分干扰素α调节人肝癌细胞MAPK和STAT1信号转导途径的研究

前 言

1.材料与方法

2.结 果

3.讨 论

参考文献

总 结

综述:丙型肝炎病毒影响干扰素介导信号转导途径的研究进展

附 录

致 谢