局部应用丝裂霉素C对良性胆管狭窄形成影响的实验研究

摘要

胆管瘢痕狭窄多由胆管损伤、肝胆管结石和胆管炎反复发作所致，其后果可导致阻塞性黄疸进而引起肝实质损害，胆汁性肝硬化，治疗颇为棘手且预后极差。目前，采用的治疗方法仍以外科手术为主，对胆管再狭窄的预防措施也是围绕手术时机、手术方式的选择、精细的操作及吻合口大小等方面进行经验性总结。有报道应用肾上腺皮质激素预防胆管瘢痕增生防止胆管再狭窄，但具体疗效尚缺乏确定的结果。因此，对胆管瘢痕狭窄形成机理和防治方法的深入研究，具有非常重要的意义。
　　 许多抗纤维化的药物证实在增生性疾病中有效，丝裂霉素C(Mitomycin C，MMC)是由头状链霉菌分离出来的抗肿瘤抗生素，目前认为，MMC对于成纤维细胞增殖的抑制作用，是氟尿嘧啶的100倍，并具有时间依从性，作用时间可达到无限期抑制增生，同时与剂量密切相关，大剂量时可以成为不可逆性抑制。已明确，局部应用MMC对瘢痕的形成具有预防和治疗的作用，并在眼科、整形外科、耳鼻喉、泌尿、骨科及上消化道等领域的瘢痕预防和消除中广泛应用，效果颇佳。
　　 目的:
　　 探讨MMC对雄性SD大鼠胆总管电凝损伤后良性狭窄形成预防的作用，研究其在胆管良性狭窄疾病中的应用可行性，为临床防治胆管狭窄寻求一条新的途径。
　　 方法:
　　 48只雄性SD大鼠(体重180-200g)用于研究。其中40只随机分成4组：假手术组、胆道狭窄模型组、电凝+低浓度药物组、电凝+高浓度药物组。8只做为药物空白对照组。
　　 动物麻醉后，将所有大鼠先于近肝门胆总管分叉下分离胆管周围软组织约1cm，假手术组关腹。胆道狭窄模型组大鼠，采用电凝钩8J能量于分叉下约0.5cm处电凝胆总管。药物组(电凝+药物1组：MMC浓度0.4mg/ml；电凝+药物2组：MMC浓度0.6mg/ml)继而于胆管损伤处采用完全浸润MMC1毫升的明胶海绵(1×1×0.5cm3)包绕，5分钟后取出明胶海绵，药物空白对照组采用电凝处理同胆道狭窄模型组大鼠，继而于胆管损伤处采用完全浸润注射用水的1毫升的明胶海绵(1×1×0.5cm3)包绕，5分钟后取出明胶海绵。术后继续饲养15天处死。
　　 记录所有大鼠术前及术后体重、进食和精神状况以及黄染，抽取门静脉学检测血常规、肝功能等指标，并记录肝脏和腹水情况。取胆管组织采用10％福尔马林固定后石蜡包埋并制成切片。对各组动物的胆管组织进行HE染色、Masson三色染色检测胆管胶原纤维构筑形态，测定胆管壁厚度，并进行显微镜检查。采用免疫组化法检测转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)，α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)，并记录毛细血管增生情况。所有指标在各组间的差异采用单因素方差分析。
　　 结果:
　　 胆道狭窄模型组和药物空白对照术后15天表现为阻塞性黄疸，血浆胆红素和谷丙转氨酶均明显高于假手术组。用药1组和2组，血浆胆红素升高程度均低于单纯胆道狭窄模型组，且用药2组低于用药1组。术后15天血常规检查显示，胆道狭窄模型组白细胞高于假手术组(P＜0.05)，红细胞和血小板均无明显差异。
　　 胆道狭窄模型组和药物空白对照组损伤部位存在明显胆管狭窄，狭窄部位以上胆管扩张明显，直径为假手术组的5倍以上，部分大鼠伴有腹水。用药组胆总管轻度狭窄，狭窄部位以上胆管直径为正常管径的1～3倍，无腹水表现。
　　 病理检查显示：胆道狭窄模型组胆管损伤部位组织，成纤维细胞增生活跃，胆管壁显著纤维化增厚，炎性细胞广泛浸润。Masson三色染色见胆管粘膜下大量胶原纤维增生，排列致密紊乱。胆道狭窄模型组胆管壁厚度明显高于假手术组(5.88±0.67mm vs2.76±0.22 mm，P＜0.01)。用药组则胆管壁增厚不明显，用药2组胆管壁增厚与假手术组无显著差异(3.12±0.45 vs2.76±0.22，P＞0.05)。
　　 免疫组化结果显示：(1)TGF-β、α-SMA、PCNA阳性细胞数，药物处理组与空白对照组、模型组、假手术组之间均有差异显著(P＜0.01)，并且用药1组及用药2组之间也有显著差异(P＜0.01)；(2)VEGF阳性积分和微血管密度的检测结果，胆道狭窄模型组和用药组明显高于假手术组(P＜0.01)，模型组和药物空白对照组结果相近；(3)微血管密度的检测结果，胆道狭窄模型组则明显低于用药组(P＜0.01)，模型组和药物空白对照组结果相近，用药1组及用药2组之间无显著差异。
　　 结论:
　　 (1)通过电凝损伤胆管法可以建立大鼠良性胆管狭窄模型，该模型主要病理变化是胆管壁成纤维细胞增殖和胶原纤维过度增生，同时伴TGF-β、α-SMA、PCNA、VEGF等明显升高；
　　 (2)局部短期应用MMC可以抑制胆管成纤维细胞的过度增殖和胶原纤维的交联，对胆管良性狭窄起到一定预防作用；但对大鼠术后体重、血常规和肝功能无毒副作用；(3)0.6mg/ml的MMC药物浓度和0.4mg/ml浓度比较，具有更强的抑制胆管狭窄的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语说明

声明

前言

材料和方法

结果

讨论

全文小结

附图

参考文献

综述一 损伤性胆管狭窄形成机制

综述二 损伤性胆管狭窄的治疗

在读期间论文撰写及发表情况

致谢