铁结合蛋白及其突变体的表达、纯化、结构和功能研究

摘要

铁是生物体必需的微量元素，然而，在人类和其他哺乳动物中，由于在血液pH值条件下Fe3+会形成沉淀及产生氧化性损伤，血液中的Fe3+被严格调控在10-18mol·L-1。为维持生长、繁殖，细菌进化出高效的从宿主体内获取铁的体系。铁结合蛋白（ferric-ion binding protein，FBP）是这类系统之一，是一些致病菌如奈瑟氏淋病双球菌（Neisseria gonorrhoeae）、奈瑟氏脑膜炎双球菌（Neisseria meningitidis）等细菌周质中的一种高度保守的铁运载蛋白，与细菌的生长，繁殖和致病能力密切相关。
　　 奈瑟氏菌属的铁结合蛋白为一水溶性单链蛋白质，由309个氨基酸残基构成，分子量约34kDa，其晶体结构显示，多肽链构成两个结构域，用一个组氨酸（His9）、一个谷氨酸（Glu57）和2个酪氨酸（Tyr195与Tyr196）残基与Fe3+配位，另有一个水分子和一个磷酸根离子作为配阴离子。铁结合蛋白与Fe3+的结合为可逆性的，Fe3+能从含铁铁结合蛋白（holo-FBP）上脱去成为脱铁铁结合蛋白（apo-FBP）。一些其它金属离子也可占据FBP中Fe3+的结合位点，因此其Fe3+的结合位点，可能是一些具有抗菌作用或抗癌活性的金属离子的潜在靶点。
　　 蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，它参与和调控生物体内的许多生命活动。通过蛋白激酶作用下的磷酸化和磷酸（酯）酶的作用下的去磷酸化，调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。已有文献报道，铁结合蛋白除了具有运载Fe3+的功能外，还有磷酸酯酶的活性，然而，其反应机理未见报道，也没有发现apo-FBP的磷酸酯酶活性。
　　 本文首次报道了apo-FBP具有催化焦磷酸键（PPi）水解的酶学功能。利用31PNMR、V-Vis、Western blotting试验、ICP-AES等技术，测定了apo-FBP催化PPi水解的动力学常数：在10mmol·L-1 pH7.4 Hepes缓冲液中，293K温度下，该酶促反应为零级反应。反应速率与PPi的浓度无关但依赖于酶的浓度。当[apo-FBP]为36、86、107、217μmol·L-1时，测得反应速率常数分别为1.02×10-2、1.04×10-1、0.10、0.135mmol.L-1·h-1。反应速率还与pH呈正相关，在相同条件下，[apo-FBP]为75μmol·L-1、[PPi]：[FBP]=50:1时，测得pH值为8.5时的反应速率是pH值为7.4时的1.2倍，pH值为7.4时的反应速率是pH值为6.5时的1.18倍。而微量Fe3+对反应有进一步的催化作用，加入2％Fe3+，反应速率增加到1.6倍。而holo-FBP催化PPi水解反应的反应速率是相同条件下apo-FBP的2.6倍。
　　 本文表达、纯化了FBP突变体Y195F，发现其不含Fe3+，且结合Fe3+的能力比原型FBP弱的多，形成三元复合物Y195F-Fe-（NTA）x的表观结合常数为1.4×103L·mol-1（10mmol·L-1 pH7.4 Hepes缓冲液，298K），而Y195F催化PPi水解的反应速率仅是相同条件下apo-FBP的1/10（[Y195F]=79μmol·L-1，[PPi]：[Y195F]=50:1）。
　　 Western blotting试验、ICP-AES结果显示，apo-FBP不含铁和磷酸根，也没有酪氨酸磷酸化现象，而holo-FBP、apo-FBP与PPi的反应产物及holo-FBP与PPi的反应产物都有酪氨酸磷酸化现象，每分子蛋白分别约含有1个、2个和1个Pi。
　　 根据以上实验结果，我们提出了apo-FBP催化PPi水解的机理是通过蛋白质的酪氨酸磷酸化过程进行的。而holo-FBP首先被PPi脱去Fe3+转变为apo-FBP，再通过酪氨酸磷酸化过程催化PPi的酶促水解反应。磷酸化的位点就是Fe3+的结合位点Y195（Y196是否是磷酸化位点有待进一步证实）。
　　 本文还制备了谷氨酸铜与apo-FBP的重组体，探索了培养晶体的条件，并用X-射线单晶衍射对重组体的晶体结构进行了初步分析。在质量分数为20％～21％PEG4000，pH7.6～7.8，蛋白浓度为1～1.8mg/ml，温度290K的条件下，可以得到大小合适，外观规整的晶体，晶体的空间群为C222，每个晶胞含有9个蛋白分子，a=130.985A，b=162.650A，c=385.525A，α=β=γ=90°。
　　 本文研究发现，细菌的铁运载蛋白FBP具有催化焦磷酸键水解，即磷酸酯酶的活性，而其作用的机理是通过铁的关键结合位点酪氨酸的磷酸化来进行的，这在细菌的能量供应方面可能具有重要的意义。同时，Cu（Glu）2-FBP的研究，也为基于FBP作为靶分子的抗菌药物的设计提供了有益探索。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一章 前言

一、致病菌铁结合蛋白

二、蛋白质可逆磷酸化和磷酸酯酶

三、本文研究的意义及思路

第二章 铁结合蛋白的表达、纯化及其水解焦磷酸钠的研究

一、仪器与试剂

(一)仪器

(二)试剂

二、实验方法

(一)holo-FBP蛋白的表达、纯化

(二)核磁共振磷谱

(三)Western Blotting试验

(四)电感耦合等离子体发射光谱

(五)数据处理

三、结果

(一)FBP的表达、纯化

(二)apo-FBP催化水解焦磷酸键的酶学功能研究

(三)apo-FBP催化焦磷酸键水解的机理研究

四、讨论

五、结论

第三章 突变体Y195F的表达、纯化和性质研究

一、仪器与试剂

(一)仪器

(二)试剂

二、实验方法

(一)突变体Y195F的表达

(二)突变体蛋白的分离、纯化

(三)电感耦合等离子体发射光谱

(四)核磁共振磷谱

(五)紫外分光光谱

三、结果

(一)Y195F的表达和纯化

(二)Y195F和Fe(NTA)2的反应

(三)Y195F和PPi的反应

四、讨论

五、结论

第四章 Cu(Glu)2-FBP的结构

一、仪器与试剂

(一)仪器

(二)试剂

二、实验方法

(一)Cu(Glu)2-FBP溶液的制备

(二)Cu(Glu)2-FBP的结晶

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

附 录

综述

参考文献

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致 谢