铁结合蛋白、铁调素及MnSOD的表达、纯化和功能研究

摘要

1.铁结合蛋白
　　 铁结合蛋白(ferric-ion binding protein,Fbp)是革兰氏阴性菌表达的含有309个氨基酸的蛋白,它位于细胞质内,是致病菌获取铁的主要蛋白。它通过一个组氨酸(His9)、一个谷氨酸(Glu57)和两个酪氨酸(Tyr195、Tyr196)与Fe3+结合,另有一个磷酸根作为协同阴离子,一个水分子作为第六个配体,将Fe3+跨过胞质运送到细胞质膜。研究发现两个酪氨酸是Fbp结合Fe3+关键位点,而协同阴离子的参与也很重要。
　　 本论文为考察酪氨酸结合位点对Fbp结合Fe3+的能力的影响,表达、纯化了单突变体蛋白Y195F、Y196F和双突变体蛋白Y195F/Y196F,利用紫外-可见光谱研究了Fe(NTA)与Y195F间的作用,发现holo-Fbp中的特征吸收峰从481nm红移到468nm,表明反应形成了Fe-Y195F-NTA三元络合物,NTA是协同阴离子,每个突变体蛋白平均结合约0.5个Fe3+。滴定实验测得表观结合常数为3.1×104L·mol-1(10mmol·L-1 Hepes缓冲溶液,pH7.4,298K)。
　　 实验室前期研究和一些文献报道还发现Fbp具有催化磷酸酯水解的功能,为研究该催化反应的机制,我们将apo-Fbp及其突变体Y195F、Y196F在10mmol·L-1 Hepes缓冲溶液中293K下与PPi反应,发现pH6.5、7.5、8.5时,Y196F催化磷酸键的断裂的速率常数分别为1.05 mmol·L-1·h-1、1.11 mmol·L-1·h-1、1.22×10-2 mmol·L-1·h-1,与apo-Fbp催化磷酸键水解的能力相近,但相应pH下,Y195F比apo-Fbp弱约10倍。同时,Dotblot试验(nc膜,磷酸根-酪氨酸抗体为一抗,驴抗鼠二抗)显示,apo-Fbp、Y195F、Y196F与PPi的反应产物都结合了磷酸根,但双突变体Y195F/Y196F不能结合磷酸根,证实Fbp催化焦磷酸水解的机制是主要通过Fbp中的铁的结合位点Tyr195的磷酸化来进行的。
　　 2.铁调素
　　 铁调素(hepcidin,HEP)是由肝细胞分泌的调节细胞中铁的代谢平衡的激素肽。它含有25个氨基酸残基并且富含半胱氨酸,受细胞中铁浓度和感染正调控,而受贫血和缺氧负调控,它与血沉症、神经退行性疾病等铁蓄积相关疾病密切相关。
　　 本论文通过克隆将hepcidin-25 cDNA与载体pMal-C2X连接,构建了表达体系,然后转化大肠杆菌BL21 DE3表达融合蛋白MBP-hepcidin-25。经过层析柱分离后获得了一个分子量为46000Da的可溶性蛋白,通过TEV消化酶等酶进行酶切有望获得HEP-25单体,为研究HEP调控细胞铁代谢的分子机制奠定了基础。
　　 3.锰超氧化物歧化酶
　　 锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)是真核细胞的线粒体中表达的一种重要的抗氧化酶,通过催化超氧化离子自由基O2-的歧化反应保护细胞免受氧化应激的损伤。
　　 本论文构建了MBP-MnSOD质粒并将其转化大肠杆菌Rossetta DE3 plus,然后用IPTG诱导表达,经过Amylose亲和柱和排阻层析的分离纯化,获得了可溶性的融合蛋白MBP-MnSOD,通过酶切可获得MnSOD,为MnSOD以及Mn的相关生物功能和体内代谢机制的研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一章 前言

一、致病菌铁结合蛋白Fbp

二、铁调素Hepcidin

三、锰超氧化物歧化酶MnSOD

第二章 铁传递蛋白及其突变体Y195F、Y196F和Y195F/Y196F的表达及纯化

一、仪器与试剂

(一)仪器

(二)试剂

二、实验方法

(一)Y195F蛋白Tyr196位点的突变

(二)holo-Fbp、Y195F、Y196F及Y195F/Y196F的表达、纯化

三、结果

(一)Y195F蛋白Tyr196位点的突变

(二)holo-Fbp、Y195F、Y196F及Y195F/Y196F的表达、纯化

四、讨论

五、结论

第三章 Fbp催化焦磷酸水解的机制研究

一、仪器与试剂

(一)仪器

(二)试剂

二、实验方法

(一)试剂准备

(二)31P核磁共振磷谱

(三)数据处理

(四)Dotblot实验

三、结果

(一)Y195F、Y196F与PPi反应动力学

(二)Dotblot实验

四、讨论

五、结论

第四章 Fbp突变体Y195F与Fe(NTA)结合反应研究

一、仪器与试剂

(一)仪器

(二)试剂

二、实验方法

(一)紫外吸收光谱

(二)数据处理

三、结果

(一)Y195F和Fe(NTA)的反应时间测定

(二)Y195F和Fe(NTA)的滴定反应

四、讨论

五、结论

第五章 铁调素Hepcidin的原核表达及纯化

一、仪器与试剂

(一)仪器

(二)试剂

二、实验方法

(一)Hepcidin-25表达体系的构建

(二)Mbp-hepcidin的表达及纯化

三、结果

(一)MBP-hepcidin的诱导表达

(二)紫外吸收光谱

(三)MBP-hepcidin酶切

四、讨论

五、结论

第六章 啤酒酵母MnSOD表达及纯化

一、仪器与试剂

(一)仪器

(二)试剂

二、实验方法

(一)MBP-MnSOD质粒构建

(二)MBP-MnSOD的融合表达

三、结果

(一)MBP-MnSOD质粒的构建

(二)MBP-MnSOD的融合表达

四、讨论

五、结论

附录 测序结果

参考文献

综述

参考文献

致谢