抑制自噬与抗血管联合治疗肝癌的实验研究

摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，具有恶性程度高、易转移复发的特点，严重危害国人的生命健康。肝癌的治疗目前仍是以手术为主的综合治疗，但是，多数患者确诊时已经是肿瘤发展的中后期而不适合接受手术。
　　 放化疗是综合治疗的重要手段，但肝癌对放化疗不敏感，致使综合治疗疗效仍不理想。
　　 因此,探索新的肿瘤治疗靶点和方法对肝癌治疗具有重要的意义。
　　 过去的几年中，国内外相关学者在新生血管与肝癌的靶向治疗方面有了更深入的认识，一些新的治疗靶点被提出并展示出积极的应用前景。对肝癌的研究表明，VEGF的异常高表达是肝癌的一大生物学特征，这也与其不良的预后和复发转移有着直接的关系。因此，以肝癌异常上调的血管生成机制作为靶点的治疗方案被提出，抗血管新药被研制。但是，抗血管药物单独用药往往不能达到理想的效果，这大大影响了其实际应用,其中的机制也尚不明确。
　　 研究表明缺血缺氧可以诱导自噬。自噬可通过降解衰老受损的细胞器和大分子蛋白，给细胞提供生物合成的小分子底物，维持细胞的稳态，帮助细胞应对恶劣的生存条件。因此，肝癌血管生成抑制治疗时诱发的自噬，可能起到保护肝癌细胞，降低治疗效果的作用。为了证实这一猜想，本课题从以下三个方面进行研究：第一部分探讨抗血管生成药物贝伐单抗（Bevacizumab Beva）对肝癌体内生长和自噬发生的影响；
　　 第二部分，体外模拟抗血管药物造成的营养缺乏，探讨自噬在肝癌细胞适应缺血环境中的作用及机制；第三部分，自噬抑制联合抗血管治疗（Beva）对肝癌生长的影响及机制探讨。
　　 第一部分：贝伐单抗（Bevacizumab Beva）对肝癌体内生长和自噬发生的影响首先建立肝癌SMMC7721种植瘤模型，之后抗血管生成药物Beva 处理观察疗效。
　　 结果表明，Beva 单独用药对SMMC7721种植瘤具有一定的疗效。接下来，我们分别用免疫组化和蛋白电泳的方法，检查Beva对肿瘤组织所造成的影响，我们发现，经过Beva 处理的肝癌组织血管密度降低，同时肝癌细胞自噬水平上调。
　　 第二部分：自噬在肝癌细胞适应缺血环境中的作用及机制本部分实验以EBSS 培养基在体外模拟Beva对SMMC7721种植瘤造成的缺养微环境，观察缺养条件下自噬抑制对肝癌细胞产生的影响。首先，我们选择3-MA 做为自噬抑制剂，并向SMMC7721和Hep3B中转染可以表达自噬标志性分子LC3的质粒——GFP-LC3。并在荧光显微镜下观察GFP-LC3的表达间接自噬的发生情况,以确定低养培养对肝癌细胞自噬的诱导以及3-MA 抑制自噬的有效性。接下来，我们用CCK-8 检测低养培养条件下自噬抑制的肝癌细胞的细胞活力，结果发现，低养培养联合自噬抑制进一步降低了肝癌细胞在低养培养条件下的细胞活力。然后，我们用DAPI 染色和流式双染检测细胞凋亡，结果证明，低氧培养联合自噬抑制更加促进了肝癌细胞SMMC7721和Hep3B的凋亡。为了使结果更加严谨，我们向SMMC7721和Hep3B细胞转染了siBeclin1质粒来抑制自噬，从光镜和DAPI的结果，同样证实了上述实验结果。因此，我们得到结论：自噬对缺养的肝癌细胞起到一定的保护作用，抑制自噬，可促进缺养条件下肝癌细胞的凋亡。
　　 第三部分：自噬抑制联合抗血管治疗（Beva）对肝癌生长的影响及机制探讨在本部分试验中，效果稳定、毒副作用小的氯喹（Chloroquine CQ）被选作体内自噬抑制剂。我们首先建立裸鼠SMMC7721种植瘤模型，之后观察Beva 单独和Beva联合CQ（体内自噬抑制剂）对肿瘤疗效的影响。结果证实，Beva 联合CQ 可以起到更好的肿瘤抑制效果，与单独Beva 处理组相比，肿瘤在体积和重量上都有明显降低。
　　 进一步的免疫组化和TUNEL 染色，分别证实了与单独Beva 处理相比，联合处理组细胞的增殖能力的降低（通过PCNA抗体检测）、细胞凋亡率上升（通过Actived-caspase3抗体检测和TUNEL 染色检测）。以上结果表明：对于肝癌种植瘤，抑制自噬可对Beva的抗肿瘤效果起到协同的作用，同时也表明，抑制自噬可能是一种提高抗血管生成药物疗效的一种策略。
　　 综上所述，我们的研究结果提示以下结论：
　　 1.贝伐单抗的抗血管治疗可引起SMMC7721种植瘤细胞自噬的上调。自噬又具有缺血缺氧下维持细胞稳态的作用，该结果提示自噬可能是抗血管治疗时肿瘤细胞自我保护的一种机制。
　　 2.抑制体外低养培养条件下肝癌细胞的自噬，可以降低细胞活力，促进其凋亡。
　　 这提示可以将抗血管药物与自噬抑制剂联合应用，以期获得更好的治疗效果。
　　 3.体内抗血管药物与自噬抑制剂联合应用，比单独应用抗血管药物更能抑制肝癌的生长和促进肿瘤细胞的凋亡，有望为临床治疗提供一种新的治疗策略。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分 贝伐单抗对肝癌体内生长和自噬发生的影响

第二部分 自噬在肝癌细胞适应缺血环境中的作用及机制

第三部分 自噬抑制联合贝伐单抗对肝癌生长的影响及其机制探讨

综述 肝癌的抗血管治疗

附 录

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致 谢