失神经支配人喉内肌纤维表型转换和肌球蛋白重链转型规律的研究

摘要

骨骼肌纤维的收缩特性取决于肌球蛋白重链（myosin heavy chain, MHC）的组成，不同收缩性质肌纤维类型的比例组成决定了肌肉组织的类型和功能特性。正常情况下，MHC组成的差异反映了不同类型肌肉独特的生理特性。长期失神经支配导致喉内肌萎缩纤维化是神经修复后肌肉功能恢复不佳的主要原因，表现为肌纤维收缩特性进行性改变致肌肉功能失代偿，不同类型的肌纤维对失神经损伤的反应不一，表现为肌纤维中MHC组成和程度的转变差异，反映了肌纤维对神经损伤的适应性重塑过程。
　　 在不同种属和不同功能类型的肌肉中，即使是同一种肌纤维类型，在失神经支配后的纤维表型转换和MHC 转型的规律也有差异。因此，本研究对失神经支配不同时间的人喉外展肌与内收肌分别进行肌纤维形态转变及肌球蛋白重链表型转换规律的研究，探讨人喉外展肌与内收肌失神经支配后的肌纤维表型转换及MHC 转型的规律，为临床喉返神经修复手术的可行性和时机选择提供理论依据。本研究共分为四个部分：
　　 第一部分失神经支配对人外展肌与内收肌肌纤维形态转变的影响
　　 目的：探讨失喉返神经支配对人喉外展肌与内收肌肌纤维形态改变的影响，为临床喉返神经修复的可行性提供理论依据。方法：外展肌取自环杓后肌，内收肌取自环杓侧肌。人正常环杓后肌和环杓侧肌作为对照组各7例，各组病例的喉内肌按喉返神经损伤的不同时间分组：环杓后肌共38例，其中失神经6～12月组7例，l～2年组10例、2～3年组8例、3～6年组8例及大于6年组5例；环杓侧肌共29例，其中失神经6～12月组7例，l～2年组6例、2～3年组6例、3～6年组6例及大于6年组4例。分别采用HE 染色、Masson 三色染色，图像分析系统定量分析失喉返神经支配后喉外展肌和内收肌肌纤维截面积、胶原纤维截面积和平均肌纤维直径的变化。结论：失神经支配对喉内肌肌纤维形态学的影响存在差异，以环杓侧肌为代表的喉内收肌肌萎缩速率慢于以环杓后肌为代表的喉外展肌。失神经6-12月和3-6年分别是环杓后肌和环杓侧肌肌纤维形态转变的关键期，提示恢复环杓后肌声带外展功能的神经再支配手术应尽量选择在损伤1年内进行，而恢复环杓侧肌声带内收功能的神经再支配手术可以选择在损伤3年内进行，适时的临床干预可延缓喉肌进一步萎缩纤维化，且此时的喉肌尚具备较好的肌肉再生的形态学基础。
　　 第二部分人正常喉外展肌与内收肌肌球蛋白重链表型的研究
　　 目的：通过研究人正常两种喉内收肌（环杓侧肌与甲杓肌）以及喉外展肌（环杓后肌）的MHC表型组成的差异，从分子水平探讨喉外展肌和内收肌表型差异相应的生物学特性，为研究失喉返神经后的喉内肌肌纤维表型转换规律提供正常对照。方法：7例正常喉内肌均来源于全喉切除术标本，外展肌取自环杓后肌；内收肌取自环杓侧肌和甲杓肌，分别采用免疫组织化学荧光染色、荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western-blot 法检测分析肌球蛋白重链表型mRNA及蛋白表达水平的差异。结论：在mRNA和蛋白水平，喉外展肌与内收肌的MHC 各表型的表达均存在显著差异，这种MHC表型的差异可能是与喉肌不同复杂的功能如呼吸，发音以及气道保护功能相适应的。
　　 第三部分失神经支配后人喉外展肌肌球蛋白重链表型转换的定量研究目的：观察失神经支配不同时间的人喉外展肌(环杓后肌)MHC 各表型的表达变化，探讨失神经支配喉外展肌肌纤维转型的规律，为临床恢复外展功能的修复手术时限选择提供理论依据。方法：38例环杓后肌按喉返神经损伤的不同时间分组：6～12月(7例)，l～2年(10例)、2～3年(8例)、3～6年(8例)及大于6年组(5例)；人正常环杓后肌7例作为正常对照组。分别采用免疫组织化学荧光染色法及图像分析、RT-PCR 法及Western-blot 法观察分析失喉返神经支配后不同时间环杓后肌MHC 各表型的转换规律。结果：1.免疫荧光染色：随着失神经时间的延长，MHC-I表达逐渐下降，而MHC-II表达逐渐升高（P<0.05），以失神经1-2年为关键期；2. RT-PCR。结论：失神经1-2年为喉外展肌MHC 转型的关键期，提示在这一时间段前即失神经1年内进行喉返神经修复术，可能较好地恢复喉外展肌的形态和功能。
　　 第四部分失神经支配后人喉内收肌肌球蛋白重链表型转换的定量研究
　　 目的：观察失神经支配不同时间的人喉内收肌(环杓侧肌)MHC 各表型的表达变化，探讨失神经支配喉内收肌肌纤维转型的规律，为临床恢复内收功能的修复手术时限选择提供理论依据。方法：29例环杓侧肌按喉返神经损伤的不同时间分组：6～12月(7例)，l～2年(6例)、2～3年(6例)、3～6年(6例)及大于6年组(4例)。人正常环杓侧肌7例作为正常对照组，分别采用免疫组织化学荧光染色法及图像分析、RT-PCR 法及Western-blot法观察分析失喉返神经支配后不同时间的环杓侧肌MHC 各表型的转换规律。结果：1.免疫荧光染色：失神经3-6年前各时间组，MHC-I、II表达的差异无统计学意义（P>0.05），失神经3-6年组MHC-I、II表达荧光灰度降低，与失神经>6年组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；2.RT-PCR 结果：MHC-I、II-mRNA表达变化无统计学意义（P>0.05）、但MHC-Iia-mRNA表达降低，MHC-Iix、MHC-Iib、embryonic-MHC、peri-natalMHC-mRNA 均升高（P<0.05），以失神经3-6年为关键期；3.Western-blot：MHC-I、II表达变化均无统计学意义(P>0.05），但MHC-Iia表达降低，MHC-Iix 升高（P<0.05），以失神经3-6年为关键期。与环杓后肌比较：1.喉内收肌在失神经支配后MHC-I 型表达变化不显著，仅出现MHC-II 亚型之间由Iia 向Iix、Iib的转型；而外展肌不仅表现为MHC-I表达下降，同时还出现I、Iia 向Iix、Iib的转型；2. 外展肌和内收肌MHC 转型的关键期不同，环杓后肌在失神经后1-2年，而环杓侧肌则在失神经后3-6年。结论：由于不同收缩性质肌纤维类型的比例组成导致肌肉组织类型和功能特性的差异，失神经支配对喉外展肌和内收肌的肌球蛋白重链表型转换的影响是有区别的。喉内收肌的MHC 各表型的表达变化相对晚于外展肌，且肌纤维转型的程度较小。由于失神经3-6年为喉内收肌MHC 转型的关键期，提示在这一时间段前即失神经3年内进行手术，可能较好地恢复喉内收肌的形态和功能.
　　 全文结论:1. 形态学研究：不同喉内肌肌纤维对失神经支配的反应有差异，在形态学上，表现为以环杓侧肌为代表的喉内收肌肌萎缩速率明显慢于以环杓后肌为代表的喉外展肌； 失神经1年内是外展肌环杓后肌肌萎缩纤维化进展最显著时期；而内收肌环杓侧肌肌萎缩纤维化进展最显著时期则在失神经3-6年；2．肌球蛋白重链组织水平的研究：失神经支配后，喉外展肌和内收肌的embryonic和peri-natal-MHCmRNA表达一致上调，体现了喉肌的再生。喉外展肌在mRNA水平出现MHC-I、Iia表达下调，Iix、Iib表达上调；蛋白水平出现MHC-I、Iia表达下调，MHC-II、Iix表达上调，均以失神经1-2年为关键期；而内收肌的MHC-I、MHC-II蛋白表达及MHC-ImRNA表达水平保持稳定不变，而仅在MHC-II 各亚型之间有所调整，体现在mRNA水平MHC-Iia表达下调，MHC-Iix、Iib表达上调，蛋白水平MHC-Iia表达下调和MHC-Iix表达上调，均以失神经3-6年为关键期；embryonic及Iib 型MHC在蛋白水平均为阴性表达；研究提示无论mRNA 还是蛋白表达水平，喉内收肌的肌纤维MHC 转型的速率要慢于外展肌，内收肌MHC表型转换相对晚于外展肌；失神经支配后外展肌环杓后肌肌纤维转型的速率和程度要大于内收肌环杓侧肌；
　　 3．失神经后1-2年和3-6年分别是喉外展肌和内收肌表型转换的关键期，提示分别在上述病程之前进行喉返神经修复，可能较好地恢复喉外展肌和内收肌的形态和功能。因此，需恢复环杓后肌声带外展功能的延期神经修复术应在损伤1年内进行，而需恢复环杓侧肌声带内收功能的延期神经修复术应在损伤3年内进行，适时的临床干预可延缓或阻止喉肌纤维进一步萎缩和纤维化，且具备较好的肌肉再生的形态学和肌球重链蛋白的功能基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分失神经支配对人外展肌与内收肌肌纤维形态转变的影响

第二部分人正常喉外展肌与内收肌肌球蛋白重链表型的研究

第三部分失神经支配后人喉外展肌肌球蛋白重链表型转换的定量研究

第四部分失神经支配后人喉内收肌肌球蛋白重链表型转换的定量研究

全文总结

综述一失神经支配骨骼肌萎缩的组织形态学和分子生物学研究进展

综述二喉肌肌球蛋白重链的研究进展

研究生在读期间发表论文、参编著作和参加学术会议情况

致谢