基于Pyrosequencing技术的乙型肝炎病毒(HBV)耐药变异检测试剂盒性能评价和临床试用

摘要

本研究分为两部分:1、试剂盒性能评价①构建包含十个常见已知的NAs相关耐药变异标准质粒,并用之对试剂盒性能进行评价。②两种方法(双脱氧测序法和焦磷酸测序法)检测95份CHB患者血清,两者结果不相符者进行克隆测序法验证并对试剂盒性能进行评价。2、试剂盒临床试用对119例急性乙肝患者感染乙型肝炎病毒多聚酶区(HBV RT)自然变异株检测并分析。
　　 第一部分基于Pyrosequencing技术的乙型肝炎病毒(HBV)耐药变异检测试剂盒性能评价
　　 目的：早期检测到耐药突变可以指导药物的挽救治疗。本研究的目的是评价基于Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术的乙型肝炎病毒常见耐药变异检测试剂盒性能(灵敏度、特异性和可重复性等)。
　　 方法：1、构建包含十个常见NAs相关耐药变异位点标准质粒,并对以上质粒加以鉴定和定量。2、不同浓度、不同比例混合的质粒样本对试剂盒性能验证。3、服用NAs类药物单药或联合治疗治疗应答不良患者的慢性乙型肝炎患者血清及未用过NAs药物治疗的CHB患者为研究对象,分别用双脱氧测序法和焦磷酸测序法对患者感染HBV-DNA进行序列分析,对两种检测结果不符合样本再进行TA-克隆测序法进行分析,验证所开发研制的基于Pyrosequencing检测平台HBV耐药突变检测试剂盒的性能(灵敏度、特异性和可重复性等)。
　　 结果：1、获得包含I169T、V173L、L180M、A181V、T184G、A194T、S202I、M204V、N236T、M250V等十个常见NAs相关耐药变异位点序列标准质粒和A181T、M204I和野生型序列质粒。通过PCR鉴定、酶切鉴定、双脱氧测序和焦磷酸测序鉴定明确插入片段的系列与预期一致。2、试剂盒性能评价(敏感度、特异性和可重复性评价)标准质粒梯度稀释及标准质粒不同浓度混合后使用试剂盒及临床待检血清进行PCR扩增、焦磷酸测序,结果显示:1000copes/ml滴度水平以上的标准质粒及HBV-DNA1000copes/ml滴度水平以上HBV-DNA(+)血清标本均获得了有效扩增,阳性率达100％；扩增后产物进行测序焦磷酸法测序结果与Sanger法测序结果的符合率为100％。在1000copes/ml滴度水平不同比例(野生型和突变型)混合的质粒的测序结果:变异株质粒占总质粒≥10％时焦磷酸测序法检测出来阳性率达100％；在1000copes/ml滴度水平变异型质粒占总质粒10％使用试剂盒对分别进行10—20次重复焦磷酸测序,其测序结果符合率为100％；焦磷酸测序法和直接测序法检测我国常见B基因和C基因型HBV病毒株感染的CHB患者血清标本95例,对两者结果符合率进行分析,两者完全符合率88.4％(84/95),同时评价所开发研制的基于Pyrosequencing检测平台HBV耐药突变检测试剂盒的性能。
　　 结论：所研发的基于焦磷酸测序法HBV耐药突变检测试剂盒可以特异性扩增我国常见B基因和C基因型HBV病毒株,扩增效率高,保证Pyrosequencing整个检测体系的特异性与灵敏度。充分发挥Pyrosequencing技术平台检测结果准确,检测位点灵活的特点。
　　 第二部分基于Pyrosequencing技术的HBV耐药变异检测试剂盒临床试用-急性乙肝病毒感染者中核苷(酸)类似物相关耐药准种的检测分析
　　 目的：了解急性乙型肝炎病毒感染者中HBV聚合酶区核苷(酸)类似药物相关耐药变异准种的分布情况。
　　 方法：收集119例HBV DNA阳性急性乙型肝炎患者血清,分别采用巢式PCR产物直接测序、焦磷酸测序和TA-克隆测序等方法对HBV聚合酶区(RT)与核苷(酸)类药物耐药相关的常见突变位点(rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250等)进行检测分析。
　　 结果：PCR产物直接测序法检出感染HBV耐药变异株患者6例(5.04％),分别为rtM204I1例、rtM204V2例以及rtA181V3例；焦磷酸测序法在上述6例病人的基础上共检测出9例耐药准种感染(rtA181V+rtM204I1例、rtM204I2例、rtA181V4例以及rtM204V2例),总检出率7.56％；对此9例耐药准种阳性标本进一步行巢式PCR产物TA-克隆测序分析,结果与焦磷酸测序法的结果大体相符,部分样本中有2种或2种以上耐药准种共存。
　　 结论：急性HBV感染者体内存在HBV核苷(酸)类似物耐药准种,焦磷酸测序技术可方便、准确地用于HBV耐药准种的检测。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写、符号

前言

第一部分 基于焦磷酸测序技术的HBV多聚酶区常见耐药变异检测试剂盒的性能评价

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

5.参考文献

第二部分 基于焦磷酸测序技术的HBV多聚酶区常见耐药变异检测试剂盒临床试用--急性乙肝病毒感染者中核苷(酸)类似物相关耐药准种的检测分析

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

5.参考文献

综述 焦磷酸测序技术及其新进

参考文献

附录

致谢