多期联合疟疾疫苗抗原结构与免疫保护作用的研究

摘要

疟疾仍是严重危害人类健康的寄生虫病。由于疟原虫抗药性的产生和扩散，以及蚊媒对杀虫剂产生抗性并逐渐蔓延，使得传统的疟防措施面临严峻挑战。研发安全、有效的疟疾疫苗是当今最有希望的疟疾防治方法之一。疟疾相关流行病学调查以及实验室研究结果均表明，研制有效的疟疾疫苗是可行的。长期在疟疾流行区生活的居民体内可以产生针对疟疾的免疫力，在高疟区，10岁以上的人群极少发生重症疟疾。
　　 从长期生活在西非疟疾流行区的成年人体内提取的IgG，被动免疫治疗重症疟疾患儿，能使其外周血原虫密度降低99％。此外，给志愿者反复接种经辐照减毒的疟原虫子孢子，可使人体产生完全的保护性免疫力。这些研究结果为研制有效疟疾疫苗提供了重要依据。疟疾疫苗研究已进行了近三十年，目前已鉴定了一批包含疟原虫生活史各期的疫苗候选抗原。这些抗原在动物试验中都能产生较高水平的特异性抗体，并且在体外或动物模型中显示出不同程度的保护效力，其中一些疫苗候选抗原已进入临床研究，并显示出较好的免疫保护效果，如以恶性疟原虫环子孢子蛋白为基础的RTS,S疟疾疫苗已进入III 期临床试验，其疫苗制剂RTS,S/ AS01E在非洲儿童中进行的临床试验显示出一定的保护力（39.2％～45.8％），能持续15个月以上。然而，疟疾疫苗研发仍面临一些的困难，包括：（1）疟疾免疫保护机制尚不清楚，现有疫苗候选抗原免疫原性较弱，单独使用不能产生有效的免疫保护效力；（2）缺乏有效的动物模型以评价疫苗的体内免疫保护效力；（3）疟原虫抗原变异和存在多种免疫逃避的机制；（4）缺乏强效人用疫苗佐剂等。
　　 研制由疟原虫生活史多个时期抗原组成的多期联合疫苗是当今疟疾疫苗的发展趋势。由于疟原虫生活史复杂，疟原虫抗原有明显期特异性和株间变异，因此普遍认为，一个有效的疫苗需要由针对多个生长环节的抗原组成，这样可增强疫苗的有效性和克服疟原虫变异性等问题。特别是将红内期抗原与红外期抗原联合，这种联合疫苗对红内期和红外期原虫均能产生杀灭作用。此外，选用合适的人用佐剂也是疟疾疫苗研发的重要内容。研究已表明，疟疾保护性免疫需要相当高的免疫应答反应。因此需要寻找或研制一种能在人体应用的强效佐剂，并与疟疾疫苗抗原联合应用。
　　 本实验室在疟疾疫苗研发方面已开展了系列工作。PfCP-2.9抗原是由本实验室设计和研制的一种红内期疟疾疫苗候选抗原，该抗原是由恶性疟原虫裂殖子表面抗原1（MSP1）和顶端膜抗原1（AMA-1）的C-末端片段融合而成。在前期的实验室和临床研究中，该抗原显示出良好的发展前景：（1）在毕氏酵母分泌表达系统中表达产量高，且可溶性和稳定性高；（2）在小鼠、家兔、猴动物模型中均显示较强的免疫原性，在家兔中能诱导产生较单个组分高10倍以上的抗体；（3）家兔和恒河猴的免疫血清在体外有良好的抑制疟原虫生长的效力；（4）两次临床试验结果显示该抗原在人体具有良好的安全性和免疫原性。然而，PfCP-2.9融合抗原的构象是个尚未解决重要问题，特别是这两个二硫键十分丰富的蛋白融合为一个分子后，是否能形成各自的正确构象以及两个抗原是否存在相互作用等问题，均受到普遍关注。
　　 本研究采用多维核磁共振NMR 技术对PfCP-2.9蛋白结构进行解析。我们制备了15N 单标记和13C、15N 双标记PfCP-2.9 重组蛋白以及15N 单标记PfMSP119 重组蛋白，通过将融合蛋白中指认的氨基酸化学位移与已知单个组分氨基酸化学位移的对比，分析其结构变化。此外，我们开展了以PfCP-2.9和PfCSP-2抗原为基础的多期联合疫苗的免疫学和临床前研究。本研究取得主要结果如下：
　　 （一）PfCP-2.9疫苗候选抗原的结构解析
　　 为研究PfCP-2.9抗原的三维结构，我们在毕赤酵母表达系统中表达了15N单标记、15N、13C 双标记PfCP-2.9蛋白及15N 单标记PfMSP119蛋白，用于NMR分析。在制备样本的过程中，我们遇到了蛋白降解和表达量低等问题。通过采用小型罐发酵以及严格控制和优化发酵条件等途径，获得了用于磁共振分析的蛋白样品。HNCA，HNCACB，CBCA(CO)NH，HNCO和HN(CA)CO 实验被用来进行主链原子信号指认；HBHA(CO)NH，(H)CC(CO) NH，CC(CO)NH和15N-TOCSY-HSQC实验被用来进行侧链原子信号指认。对主链碳原子的指认获得的数据如下：分别指认了PfAMA1-III、连接区、PfMSP119 部分的39个、12个和71个氨基酸残基；同时获得了部分侧链的化学位移数据。PfAMA1-III 部分被指认的残基定位分散于分子的不同区域，包含有结构区域和无序区域，且许多位于核心结构区的残基被指认；PfMSP119部分大多数氨基酸残基均被指认。
　　 三维15N-标记 NOESY-HSQC 波谱实验用来分析化学位移。绝大多数PfCP-2.9分子中被指认的氨基酸残基表现出的化学位移与已报道的单个组分的化学位移高度相似。仅有少量氨基酸的化学位移与已报道的数据有较大差异，由于在已报道的PfAMA1-III和PfMSP119的NMR 研究中，与本项研究使用的缓冲液条件不同，因此这些差异被考虑为实验条件差异所致。
　　 将PfCP-2.9与PfMSP119的HSQC 图谱进行重叠，结果显示PfCP-2.9分子中的PfMSP119的结构与单独的PfMSP119分子的结构完全一致。除了His150和Ser238 残基，所有氨基酸残基的化学位移峰的差别都在实验误差范围内。His150和Ser238 残基分别位于两种分子的N 端和C 端，易受样品条件不同的影响。经过对比两种分子的波谱图，未发现任何信号消失。这些数据强有力地证明了PfCP-2.9分子中的PfMSP119 部分的结构与单独的PfMSP119分子的结构完全一致。
　　 将15N 单标记PfCP-2.9与PfMSP119 同时进行横向驰豫率的测定，结果显示，位于PfCP-2.9分子的氨基酸残基的横向驰豫率整体较高，这是因为PfCP-2.9分子具有较高的分子量和较慢的分子翻转。将两种分子中的数据进行重叠，发现两者有极高的相似度，未在任何区域发现明显区别。该结果提示PfCP-2.9分子中的PfMSP119 部分与单独的PfMSP119分子相比，没有氨基酸残基化学或构象的变化，提示PfMSP119部分与PfAMA1-III 部分和连接区部分无微弱的相互作用。
　　 （二）多期联合疟疾疫苗免疫学及临床前研究
　　 为研制多期联合疟疾疫苗，本实验室前期已构建了恶性疟原虫红外期抗原PfCSP-2。该抗原由由恶性疟原虫3D7株的环子孢子蛋白（CSP）的NANP 重复区及C 端部分侧翼序列融合而成。在前期的实验中，该疫苗候选抗原也显示出良好的发展前景，包括在毕氏酵母分泌表达系统中高水平表达、蛋白可溶和稳定性高、纯化制备简便，并在小鼠、家兔动物模型中均显示出很高的免疫原性等。在此基础上本研究开展了多期联合疫苗多种动物的免疫学、新型佐剂以及临床前相关研究：
　　 1.新型佐剂选用：疫苗的组成包括两个方面，一是抗原，二是佐剂。作为疫苗，佐剂的作用与抗原同等重要，特别是目前尚缺乏人用强效佐剂。为此，本项研究选用了5种人用疫苗佐剂或组合：MF59、GLA、MF59+GLA、铝佐剂+GLA、铝佐剂+CpG，并在小鼠和恒河猴体内进行了佐剂比较研究。
　　 BALB/c小鼠8组，每组8只小鼠，分别免疫MF59+GLA、MF59、GLA、ISA720、弗氏佐剂、铝佐剂、铝佐剂+GLA与PfCP-2.9蛋白的疫苗制剂。颈背部皮下注射共免疫3次，每次免疫后取血。采用ELISA 方法检测免疫血清的特异性抗体水平，结果显示除了弗氏佐剂和ISA720两种非人用佐剂外，铝佐剂＋GLA＋抗原组特异性抗体水平最高，从该组免疫血清中纯化的抗体显示出一定的体外抑制原虫生长效力。
　　 恒河猴5组，每组3只恒河猴，分别免疫ISA720、铝佐剂+CpG、铝佐剂+GLA、铝佐剂、MF59+GLA与PfCP-2.9+PfCSP-2蛋白的疫苗制剂。大腿肌肉注射共免疫3次，每次免疫后取血。采用ELISA 方法检测免疫血清的特异性抗体水平，实验结果显示铝佐剂+GLA组PfCP-2.9 特异性抗体水平最高，其纯化的抗体显示出明显的体外抑制疟原虫生长效力。
　　 综合考虑目前在临床前及临床试验中佐剂应用的实际情况和佐剂的安全性等问题，以及佐剂的实际效果需要在临床试验中才能体现等实际情况，经与世界卫生组织和美国IDRI 专家研讨，确定铝佐剂＋GLA为本疫苗的佐剂。
　　 2.两种抗原剂量配比：在实际应用时，多期联合疟疾疫苗面临着两种抗原剂量如何配比的问题，为此我们在小鼠模型中进行了最佳剂量配比实验。BALB/c小鼠5组，每组6只小鼠，PfCP-2.9:PfCSP-2的量分别为1:1、1:2、2:1、1:4、4:1。颈背部皮下注射共免疫3次，每次免疫后取血。采用ELISA 方法检测免疫血清的特异性抗体水平，结果显示抗原配比1:1组PfCP-2.9抗体水平略高，其次为4:1、2:1、1:2、1:4组，统计分析显示各组间均无显著差异；第1～4组PfCSP-2抗体水平接近，以抗原配比1:2组略高，其次为1:4、1:1、2:1组，4:1组抗体水平明显较低，统计分析显示第1:2、1:4、1:1、2:1组间无显著差异，但均明显高于4:1组（p<0.05）。综合上述结果，我们确定两种抗原以1:1配比进行下阶段的实验。
　　 3.两种抗原相互竞争性抑制分析：为了分析PfCP-2.9与PfCSP-2抗原联合免疫时是否存在相互竞争性抑制作用，我们在小鼠和家兔动物模型中进行了分析。BALB/c小鼠4组，每组6只小鼠；家兔4组，每组5只家兔，分组包括：PfCP-2.9组、PfCSP-2组、PfCP-2.9+PfCSP-2 联合组合生理盐水对照组。颈背部皮下注射共免疫3次，每次免疫后取血。采用ELISA 方法检测免疫血清的特异性抗体水平，结果显示单独的抗原组与联合抗原组产生的特异性抗体水平接近，经统计分析均无显著差异，表明两种抗原联合免疫无明显竞争性抑制作用。
　　 4.免疫原性及体外抑制效力分析：在确定了合适的佐剂、合适的抗原剂量配比和证实了抗原之间无相互竞争性抑制作用的基础上，我们在小鼠、家兔和恒河猴动物模型中开展了由新型佐剂多期与两个疫苗抗原组成的联合疟疾疫苗（PfCP-2.9+PfCSP-2/Al+GLA）的免疫原性实验以及体外抑制原虫生长效力的分析。
　　 BALB/c小鼠4组，每组6只小鼠，分组包括：PfCP-2.9+PfCSP-2/Al+GLA组、Al+GLA对照组、PfCP-2.9+PfCSP-2/Al组、Al对照组；家兔4组，每组5只家兔，分组包括：PfCP-2.9组、PfCSP-2组、PfCP-2.9+PfCSP-2 联合组合生理盐水对照组；恒河猴2组，每组5只恒河猴，分组包括：PfCP-2.9+PfCSP-2/Al+GLA组、PfCP-2.9+PfCSP-2/Al组；颈背部皮下或肌肉注射共免疫3次，每次免疫后取血。采用ELISA 方法检测免疫血清的特异性抗体水平，结果在小鼠、家兔和恒河猴动物模型中，该疫苗均显示出良好的免疫原性，能刺激动物产生较高水平的特异性抗体，联合佐剂Al+GLA 较单独Al佐剂组抗体水平高，免疫血清能识别天然抗原，并在体外显示出一定的抑制疟原虫生长效力。
　　 5. 疫苗稳定性初步观察：为了观察该新型多期联合疟疾疫苗的稳定性，我们采用以引起动物免疫应答的效力进行评估，即测定半数有效剂量ED50。该方法是将多价多期联合疟疾疫苗抗原保存在4℃和37℃条件下，取不同时间点的多价多期联合疟疾疫苗抗原，连续稀释5个稀释度，与铝+GLA 佐剂混合后接种BALB/c小鼠，每个稀释度10只，雌雄各半。4周后采血取血清，用ELISA 法测定血清样本，计算ED50值。结果显示，4℃条件下6个月内和37℃条件下7天内的疫苗样品，其半数有效剂量ED50保持在稳定水平，无显著差异，表明疫苗抗原在冻干状态下至少能在4℃条件下6个月内和37℃条件下7天内保持其免疫效力的稳定。
　　 小结：多期联合疟疾疫苗是有希望的疟防新措施，在本实验室对疟疾疫苗长期研究的基础上，本项研究开展了对PfCP-2.9 疫苗候选抗原的结构解析和多期联合疟疾疫苗免疫学及临床前研究。结果显示：（1）AMA1-III和MSP119在PfCP-2.9分子中均具有良好的结构，并维持了其天然构象；（2）PfCP-2.9分子中的AMA1-III和MSP119组分无相互作用；（3）比较了多种人用佐剂的作用，选择了Al+GLA作为新型疫苗的佐剂；（4）PfCP-2.9与PfCSP-2两种抗原1:1是合适的抗原配比；两种抗原在联合应用时无明显的竞争性抑制作用；（5）新型多期联合疟疾疫苗PfCP-2.9+PfCSP-2/Al+GLA在小鼠、家兔和恒河猴动物模型中均显示出良好的免疫原性，其抗体显示出一定的体外抑制原虫生长效果；（6）两种抗原制剂在冻干状态下，至少能在4℃条件下6个月内和37℃条件下7天内保持其免疫效力的稳定。

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综述 疟疾疫苗临床试验进展及展望

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