恶性胸腔积液中肿瘤细胞的阴性富集及端粒酶检测的应用研究

摘要

研究目的：
　　 本研究的目的在于探索一种运用免疫磁珠阴性富集结合荧光原位杂交(FISH)的方法检测胸腔积液肿瘤细胞的可行性，并建立免疫磁珠阴性法富集恶性胸腔积液中肿瘤细胞的方法和标准化流程，以提高恶性胸腔积液的检出率，为良恶性胸腔积液的鉴别提供一种新的方法；另外通过免疫磁珠去除胸腔积液中的白细胞检测胸水端粒酶的活性，以明确白细胞对胸水肿瘤细胞端粒酶活性的影响。
　　 研究方法：
　　 1、收集良性、恶性胸腔积液患者的胸水标本，其中良性胸腔积液17例，恶性胸腔积液36例。
　　 2、采用免疫磁珠阴性法、密度梯度离心法富集恶性胸腔积液中的肿瘤细胞，富集后细胞涂片，分别应用瑞姬染色、免疫荧光染色及FISH进行肿瘤细胞鉴定。比较免疫磁珠阴性法和密度梯度离心法富集胸水中肿瘤细胞的敏感性、特异性。并用5、10、20、50、100个经4，6-二眯-2苯吲哚(DAPI)染色肺腺癌细胞系A549细胞分别加入20ml心功能衰竭患者胸腔积液中(约含1-10×106个细胞)，通过免疫磁珠阴性法富集，荧光显微镜检测体外加入癌细胞的回收率。
　　 3、应用TRAP-PCR-ELISA法检测经免疫磁珠阴性法及密度梯度离心法富集后的肿瘤细胞端粒酶活性。
　　 结果：
　　 1、在36例恶性胸腔积液中，应用免疫磁珠阴性法+瑞姬染色检出肿瘤细胞的阳性率为80.55％(29/36)，免疫磁珠阴性法+免疫荧光染色检出阳性细胞的阳性率为100％，免疫磁珠阴性法+FISH检出肿瘤细胞的阳性率为86.11％(31/36)；密度梯度离心法+瑞姬染色检出肿瘤细胞的阳性率为58.33％(21/36)。免疫磁珠阴性法+瑞姬染色或FISH与密度梯度离心法+瑞姬染色比较差异均有统计学意义(X2=4.00,P=0.039；X2=5.818，P=0.012)。在17例良性胸腔积液中应用免疫磁珠阴性法联合瑞姬染色或FISH及密度梯度离心法+瑞姬染色均未检出肿瘤细胞，而应用免疫磁珠阴性法+免疫荧光染色检出阳性细胞的阳性率为100％(17/17)。回收率验证实验结果显示：5、10、20、50、100个DAPI染色肺腺癌细胞系A549细胞分别加入20ml心功能衰竭患者胸腔积液中经免疫磁珠阴性法富集后回收率分别为75％、78％、82％、85％、88％，平均回收率为81.6％。
　　 2、15份胸腔积液经免疫磁珠阴性法及密度梯度离心法富集后利用TRAP-PCR-ELISA法检测富集细胞端粒酶活性(其中5例为良性胸水，10例为恶性胸水)，利用△A计算显示10例恶性胸水应用免疫磁珠阴性法富集后有7例端粒酶活性阳性表达，密度梯度离心法富集后有3例表达阳性；5例良性胸水端粒酶活性均为阴性。经McNemar'sTest分析，二者差异无统计学意义，(X2=2.25，P=0.125)。利用患者胸水肿瘤细胞相对端粒酶活性值(RTA)计算，经配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验，10例恶性胸水经两种方法富集后的RTA值比较有差异，P=0.007，免疫磁珠阴性法富集后恶性胸水肿瘤细胞RTA明显高于密度梯度离心法富集后；5例良性胸水经两种方法富集后的RTA值之间比较无显著性差异，P=0.08。
　　 结论：
　　 应用免疫磁珠阴性法富集胸腔积液肿瘤细胞是可行的，且该方法联合瑞姬染色或FISH对恶性胸腔积液的诊断具有较好的敏感性和特异性，明显高于密度梯度离心法，对于患者良恶性胸腔积液的鉴别诊断具有重要意义；而联合CK、DAPI、CD45标记的免疫荧光染色不能有效地鉴别胸腔积液中的肿瘤细胞和间皮细胞，还需寻找更特异的肿瘤细胞抗体标记物。
　　 利用免疫磁珠阴性法富集胸水肿瘤细胞后进行端粒酶活性检测去除了白细胞对肿瘤细胞端粒酶活性的影响，有利于提高检测的敏感性和特异性，利于良恶性胸腔积液的鉴别。并且恶性胸水中大量白细胞的存在会在一定程度上“抑制”肿瘤细胞端粒酶活性的表达。