Stanford A型主动脉夹层管壁生物力学及弹力纤维相关蛋白表达情况的研究

摘要

StanfordA型胸主动脉夹层(Thoracic Aortic Dissection，TAD)系主动脉血流经内膜破口沿管壁中层剥离，病变累及升主动脉以及主动脉弓部，并可累及全主动脉。从生物力学的观点看来，StanfordA型TAD的发生系主动脉管壁所承受的管腔内血流冲击应力超过了其机械强度的极限所致。虽然临床上常以TAD患者发生夹层处主动脉的管腔最大直径作为粗略估计其破裂可能的一项指标，但对TAD患者管壁各层的生物力学性质做更为精确的定量分析对于临床上更好地判断患者预后是很有必要的。然而，目前人体主动脉的力学研究数量仍很少，并多以腹主动脉瘤(Abdominalaorticaneurysm，AAA)或升主动脉真性动脉瘤为研究对象。由于动物实验表明主动脉管壁由近端至远端不同节段的力学性质有较大差异，且TAD的病理生理过程和真性ATAA并不相同，因此StanfordA型TAD患者升主动脉管壁各层的力学性质目前尚未明确。
　　 弹性纤维(Elasticfibers，EF)是主动脉这类弹力型动脉细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)的最主要成分之一，占其干重的30％。既往研究表明EF和胶原纤维在主动脉的含量和相对比例是决定管壁力学特性的最主要因素。EF是与决定管壁极限应力(FailureStress)的主要因素“胶原纤维”相对应的一类ECM，其赋予了主动脉良好的可扩张性和回坐力，决定了其顺应性和极限应变(FailureStrain)能力。管壁中层弹力片层(elasticlamellae)结构的毁损和缺失是公认的StanfordA型TAD特征性病理改变之一，因此，明确TAD发病后不同时期管壁EF的重构情况对进一步探究其力学性质变化的潜在分子基础具有重要意义，并可为筛选药物保守A型夹层的潜在分子生物学靶点提供参考。然而，既往有关ECM及EF在TAD中的研究多从胶原/弹性蛋白酶及炎性反应对ECM降解的角度展开，有关EF合成在TAD病理过程中作用的研究甚少。主动脉管壁具有生物力学功能的成熟EF的合成是一个由多种分子参与，多步骤逐级调控的复杂过程。目前有关主动脉疾病中与EF的合成异常相关的研究多以AAA为研究对象，然而，由于主动脉由近心端向远端弹性/胶原纤维比例逐渐减低，且TAD的发病机制不同于TAA，因此在TAD病例中，升主动脉管壁EF的合成是否具有异常，并由此导致了力学性质的变化，目前尚未明确合成的具体情况以及由此导致的力学性质的改变目前尚未明确。
　　 综上所述，我们在本课题中旨在通过：1、通过力学试验明确StanfordA型TAD患者升主动脉管壁力学特性的变化情况，特殊染色明确A型夹层患者升主动脉管壁形态及成熟弹性纤维含量。2、通过分子生物学实验技术手段明确StanfordA型TAD发病后，升主动脉管壁各层组织中弹性纤维相关分子(Elastic-fibre-associatedmolecules，EFAM)的表达重构情况，为探究TAD管壁力学特性改变的潜在分子基础提供相关信息。
　　 第一部分，StanfordA型TAD升主动脉力学试验及管壁成熟弹性纤维的形态学研究
　　 目的：1、明确StanfordA型TAD患者和正常人相比其升主动脉管壁力学特性的变化情况。2、明确TAD患者较之对照组升主动脉管壁成熟弹性纤维的密度及分布情况。
　　 方法：1、通过单轴拉伸试验实时记录应变.应力曲线(Strain-stresscurve)，并根据获得的高频数据计算弹性模量-应力曲线(Elasticmodulous-stresscurve)，由此获得正常对照组及StanfordA型急、慢性TAD患者升主动脉管壁内中层、外膜及全层组织拉伸至毁损时的极限阿尔曼西应变(FailureAlmansistrain，ef)、极限柯西应力(FailureCauchystress，sf)、以及极限弹性模量(PeakElasticModulus，Mp)，并进行相应统计分析对比组间差异。2、通过直线回归分析sf和Mp之间的相关性，计算相关系数。3、经HE及VG染色明确各组标本升主动脉管壁弹性、胶原纤维在各层的分布情况。
　　 结果：1、急、慢性TAD患者管壁各层的ef在周向(Circumferential，CIRC)及纵向(Longitudinal，Long)均显著低于对照组，而急、慢性TAD相比管壁各层在周、纵向ef均无显著差异。2、急、慢性TAD患者单纯分离的管壁内中层或外膜组织在周、纵向的sf均显著低于对照组。急、慢性TAD相比内膜组织的sf在周、纵向均无显著差异；而外膜显示慢性TAD组的sf在周、纵向均显著高于急性TAD。对于管壁全层组织，sf在周、纵向均显示仅急性TAD显著低于对照组，而慢性TAD与对照组无显著差异。3、弹性模量方面，分离的内中层及外膜组织在周、纵向的Mp测试结果显示：急、慢性TAD组均显著低于对照组，而急、慢性TAD相比内膜的Mp无显著差异，外膜Mp则慢性组显著高于急性组。对于全层组织，仅急性TAD患者的Mp低于对照组，慢性TAD与对照组相比无统计学差异，并显著高于急性TAD。4、各组人群内中层和外膜组织力学差异的研究显示，正常人和TAD患者升主动脉外膜组织的ef、sf、Mp在周、纵向上均显著高于各自的内膜组织。各组的管壁力学特性在周、纵向上的差异性研究提示ef在这两个方向无显著差异，而sf和Mp则显示周向显著高于纵向。5、直线回归分析显示各组人群的各层组织其sf和Mp在周向及纵向均呈高度正相关性。6、形态学研究显示TAD患者管壁特征性的弹性纤维结构毁损，其含量显著低于正常主动脉。
　　 结论：1、TAD患者升主动脉的极限扩张力显著低于正常主动脉，且急、慢性TAD相比，各层组织在周、纵向的可扩张性均无显著差异。2、StanfordA型夹层主动脉管壁的力学强度显著低于正常对照，但慢性TAD在管壁力学强度上有一定程度的代偿，主要表现为外膜组织机械强度增加。3、外膜不论在TAD患者还是正常人，其相对于内中层组织均是一可拉伸性能更好，且力学强度更大的结缔组织。4、升主动脉在周向的机械强度要显著大于纵向，但二者的可拉伸性能无显著差异，提示升主动脉管壁在不同方向的力学特性存在一定差异。5、组织学显示TAD患者管壁EF毁损严重，含量较正常升主动脉减少。
　　 第二部分，StanfordA型TAD升主动脉管壁弹力纤维相关蛋白表达情况的研究
　　 目的：明确StanfordA型TAD发病后，升主动脉管壁各层组织EFAM的表达情况，为探究导致TAD升主动脉管壁力学性质变化的潜在ECM分子机制提供相关信息。
　　 方法：1、通过普通RT-PCR及实时定量RT-PCR明确各组人群升主动脉管壁各层组织中弹性蛋白原(Tropoelastin，TE)、微纤维相关蛋白以及赖氨酰氧化酶同工酶-1(Lysyloxidaselike-1，Loxl-1)mRNA的表达含量。2、通过免疫组织化学染色行形态学研究明确上述EFAM分子对应的蛋白在升主动脉管壁的分布定位情况。3、通过蛋白印迹(Westernblot)定量分析上述EFAM在正常人和TAD患者升主动脉管壁各层的表达情况。
　　 结果：1、急、慢性TAD组管壁各层可溶性TE的mRNA及对应蛋白均较对照组有显著增加，且均以外膜增加更为显著。急、慢性TAD相比，急性TAD患者的TEmRNA含量更多，而在蛋白水平二组人群无显著差异。2、急、慢性TAD患者管壁全层组织原纤维类分子在mRNA及蛋白水平的含量均不高于正常对照组。对于单纯内中层组织，TAD患者较之对照组此类蛋白表达亦无显著增加。对于单纯外膜组织，急、慢性TAD组Emilin-1，Fibulin-4、5以及MAGP-1的含量显著高于对照组。3、成纤维细胞的标记分子DDR-2染色显示急、慢性TAD患者管壁各层阳性染色均高于正常对照，并在外膜增加更为明显。4、急、慢性TAD患者管壁各层中促进TE交联和EF成熟的关键酶Loxl-1的mRNA及蛋白含量均显著低于对照组，且慢性TAD和急性组相比显示了更低的表达含量。
　　 结论：TAD发病后，管壁弹性纤维相关蛋白的表达主要位于外膜，而内中层组织则未表现出较为活跃的表达。从表达成份来看，参与成熟弹力纤维组装的可溶性EFAM在TAD组呈现不平衡表达的情况，具体表现为无定形核心的主要成分TE较正常主动脉表达增加，而对后续组装和稳定成熟弹力纤维有重要作用的微纤维类蛋白及Loxl-1在TAD组含量无显著变化或减少。这几类蛋白在TAD组的不平衡表达可能是最终导致急、慢性期TAD和正常对照相比，升主动脉有功能的成熟弹性纤维明显减少的重要原因。