Obestatin在慢性心力衰竭肾脏水代谢异常中的作用及其机制

摘要

水钠潴留是慢性心力衰竭(CHF)的重要病理生理改变之一。心脏和肾脏是机体重要器官，维持机体内环境的稳定有赖于心脏和肾脏的密切协作，病理状态下，心功能不全往往合并肾功能减退。伴随CHF的心输出量下降，外周血管灌注压开始下降，引起一系列神经激素包括交感神经、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)、精氨酸加压素(AVP)系统等的激活，使得水钠重吸收增多，液体潴留，进而肾功能受损，而肾小球滤过率的下降又会加重水钠潴留。此过程一旦启动，心肾之间即形成恶性循环，病情逐渐恶化，临床通常称之为“心肾综合征(CRS)”。作为CHF的终末状态，心肾综合征导致机体水代谢紊乱更为突出。
　　 AVP是调节体液量的重要因子之一，能通过对肾脏集合管细胞水通道蛋白2(AQP2)的短时和长时调控来加强机体水的重吸收。然而，过量分泌的AVP能加重心脏的前负荷和后负荷，参与心室重构和引起低钠血症，与CHF及CRS不良预后相关。
　　 Obestatin是由23个氨基酸组成的多肽类激素，近期研究发现其可能与机体水代谢相关。Obestatin可以由包括胃在内的很多器官、组织产生，与ghrelin来自同一基因，最初发现二者在摄食方面有互相拮抗的作用，后来发现二者在其它方面又有相似的作用。已有研究发现ghrelin可以明显改善CHF患者的l临床症状及血流动力学指标，而obestatin的心血管作用尚不明确。我们前期在CHF患者的研究中发现心力衰竭(心衰)合并恶液质组obestatin水平升高。有研究发现obestatin可抑制口渴，减少机体的饮水，脑室内给予外源性obestatin可以剂量依赖性地抑制AVP的释放，提示obestatin可能通过AVP调节机体的水代谢。我们前期免疫组化的研究提示obestatin在肾脏的表达，提示其可能在肾脏通过精氨酸加压素以及自分泌或旁分泌的方式来调节机体的水代谢。
　　 本研究：①通过在慢性心衰、慢性肾功能衰竭(肾衰)、心肾综合征患者中观察血浆obestatin、AVP水平变化，初步探讨二者之间的相关性；②在此基础上进一步在心衰动物模型中观察obestatin对心衰时肾脏水代谢的影响，对AVP和其下游水通道蛋白2(AQP2)表达的影响；③在集合管细胞中观察obestatin对AVP-AQP2短时及长时调节机制的影响。以期初步明确obestatin在心力衰竭肾脏水代谢异常中的作用及其细胞和分子机制。
　　 第一部分：Obestatin、AVP在慢性心衰合并肾功能衰竭患者中的变化及其意义
　　 目的：在慢性心衰、慢性肾衰、心肾综合征患者中观察血浆obestatin、AVP水平变化，探讨二者之间的相关性。
　　 方法：研究对象为2011年3月～2011年10月至长海医院就诊的住院患者，对照受试者为同期来住院查体的健康者；共入选慢性肾衰患者31例、心衰患者41例、心肾综合征患者34例，与上述患者年龄匹配的健康受试者30例。采用elisa法检测慢性心衰患者、慢性肾衰患者、心肾综合征患者以及对照受试者外周血obestatin、AVP、BNP水平；运用统计学方法比较各组患者临床和生化指标的不同，计算外周血obestatin、AVP在慢性心衰、慢性肾衰、心肾综合征患者中水平变化，并探讨obestatin、AVP二者之间是否存在相关性。
　　 结果：①心肾综合征组外周血obestatin水平(355.8±14.6pg/ml)明显高于正常对照组(212.3±6.9pg/ml，P<0.01)、慢性肾衰组(246.7±6.2pg/ml，P<0.01)和慢性心衰组(258.4±17.5pg/ml，P<0.01)；慢性心衰组明显高于正常对照组(258.4±17.5pg/mlvs212.3±6.9pg/ml，P<0.05)；慢性肾衰组明显高于正常对照组(246.7±6.2pg/mlvs212.3±6.9pg/ml，P<0.01)；慢性心衰组和慢性肾衰组之间差别无统计学意义。②心肾综合征组外周血AVP水平(65.1±6.6pg/ml)明显高于对照组(38.5±3.7pg/ml，P<0.01)、慢性肾衰组(50.4±4.5pg/ml，P<0.01)和心衰组(54.6±2.5pg/ml，P<0.01)；心衰组明显高于正常对照组(54.6±2.5pg/mlvs38.5±3.7pg/ml，P<0.01)；慢性肾衰组明显高于正常对照组(50.4±4.5pg/mlvs38.5±3.7pg/ml，P<0.05)；心衰组和慢性肾衰组之间差别无统计学意义。③相关分析显示外周血obestatin与年龄、BMI、收缩压、舒张压、血钠、TC、TG、HDL-C水平无明显相关性，外周血obestatin与AVP水平呈正相关(相关系数=0.219，P<0.05)；外周血obestatin与BNP水平呈正相关(相关系数=0.220,P<0.05)；外周血obestatin与肌酐水平呈正相关(相关系数=0.176，P<0.05)。
　　 结论：心肾综合征患者、慢性心衰患者及慢性肾衰患者外周血obestatin和AVP水平均明显升高，外周血obestatin与AVP水平、BNP水平以及肌酐水平呈正相关。
　　 第二部分：Obestatin对慢性心力衰竭大鼠心功能及水代谢的影响
　　 目的：观察obestatin腹腔注射对前壁心梗所致慢性心衰大鼠心功能及其尿量的影响，以及其对心衰大鼠外周血和肾集合管AVP，AQP2表达的调节作用。
　　 方法：通过结扎大鼠心脏前降支，成功建立心梗模型30只，另外6只大鼠开胸不结扎前降支血管，建立假手术组，分组：假手术组：6只，正常饮食16周；心衰组：30只，正常饮食16周；分6组分别腹腔注射：假手术注射生理盐水组；心衰注射生理盐水组、心衰注射AVP组、心衰注射ghrelin组以及心衰注射低剂量obestatin(50μg/kg/d)组，心衰注射高剂量obestatin(100μg/kg/d)组。检测心脏超声，尿量，采用elisa法检测大鼠尿AQP2，外周血AVP及obestatin水平，采用Western-blot法检测大鼠肾集合管AVP和AQP2的表达。
　　 结果：1、注射药物4周后，与注射前相比：①心衰注射高剂量obestatin(100μg/kg)组大鼠心脏超声左心室射血分数(LVEF)值明显升高(63.4±2.8％vs59.9±2.9％，P<0.05)；尿量明显增多(19.3±1.7mlvs18.3±1.1ml，P<0.05)；尿AQP2明显减少(0.966±0.056pg/mlvs1.046±0.049pg/ml，P<0.01)；外周血AVP水平无明显变化；外周血obestatin水平明显升高(155.77±6.22pg/mlvs138.06±10.37pg/ml，P<0.01)；②心衰注射AVP组大鼠射血分数明显下降(57.0±2.7％vs59.9±2.8％，P<0.01)；尿量明显下降(17.7±0.3mlvs18.7±0.9ml，P<0.05)；尿AQP2明显上升(1.285±0.079pg/mlvs1.171±0.055pg/ml，P<0.05)；外周血AVP明显上升(3.688±0.308pg/mlvs3.074±0.264pg/ml，P<0.01)；外周血obestatin明显上升(152.49±8.44pg/mlvs141.94±7.85pg/ml，P<0.01)；③心衰注射ghrelin组大鼠心脏超声LVEF值明显升高(57.9±6.9％vs53.7±6.5％，P<0.01)；尿量、尿AQP2、外周血AVP及obestatin水平无明显变化；④假手术注射生理盐水组、心衰注射生理盐水组、心衰注射低剂量obestatin(50μg/kg)组大鼠LVEF、尿量、尿AQP2、外周血AVP及obestatin水平无明显变化；2、①与假手术注射生理盐水组相比，心衰大鼠注射AVP组4周后肾集合管AVP及AQP2表达增多(P<0.05)；心衰注射obestatin(100μg/kg)组大鼠4周后肾集合管AQP2表达减少(P<0.05)；心衰注射生理盐水，心衰注射ghrelin，心衰组注射obestatin(50μg/kg)组4周后大鼠肾集合管AQP2表达无明显改变；②与心衰注射生理盐水组相比，心衰大鼠注射AVP组4周后肾集合管AVP及AQP2表达增多(P<0.05)；心衰注射obestatin(100μg/kg)组4周后大鼠肾集合管AQP2表达减少(P<0.05)；心衰注射ghrelin，心衰注射obestatin(50μg/kg)组大鼠肾集合管AQP2表达无明显改变；
　　 结论：高剂量obestatin长期腹腔注射能明显改善心梗后心衰大鼠心功能，增加尿量并减少尿AQP2水平，对外周血AVP水平无明显影响，明显减少肾集合管AQP2的表达而对AVP表达无明显影响。
　　 第三部分：Obestatin对肾脏集合管细胞水通道蛋白2的作用
　　 目的：探讨obestatin是否通过AVP途径对肾脏内髓集合管上皮细胞3(IMCD3)细胞AQP2进行调节。
　　 方法：培养IMCD3细胞，给予不同浓度obestatin(10-8、10-7mol/L)干预及给予不同浓度AVP(10-8、10-7mol/L)干预后15分钟，半小时，1小时，6小时，24小时收集细胞，Westernblot方法检测各时间点AVP、AQP2的表达，elisa法检测各时间点cAMP表达。
　　 结果：1、培养IMCD3细胞，①给予低浓度(10-8mol/L)obestatin干预后15分钟，半小时，1小时，6小时，24小时，与干预前相比，cAMP、AVP及AQP2表达均无明显变化。②给予高浓度(10-7mol/L)obestatin干预后6小时及24小时后，与干预前相比，cAMP和AVP的表达无明显变化，AQP2表达明显减少(各组均P<0.05)。2、培养IMCD3细胞，①给予低浓度(10-8mol/l)AVP干预后15分钟，半小时，1小时，6小时，24小时，与干预前相比，cAMP和AQP2的表达均无明显变化。②给予高浓度(10-7mol/L)AVP干预后15分钟，与干预前相比，cAMP和AQP2的表达无明显变化；干预后半小时，1小时，6小时，24小时后，cAMP表达明显升高(各组均P<0.05)；干预后6小时，24小时与干预前相比，AQP2表达明显升高(各组均P<0.05)。
　　 结论：Obestatin干预不能影响肾集合管细胞AVP表达，obestatin干预可以减少肾集合管细胞AQP2表达，表明obestatin参与肾脏水调节的机制可能与AVP途径无关而与AQP2的长时调控机制相关。