代谢组学技术在疾病动物模型研究中的应用

摘要

代谢是生命的本质。任何疾病的发生和发展都会影响机体代谢，从而导致体液中代谢物质发生显著变化。通过比较机体生理与疾病状态，可以找到与疾病诊断相关的一组生物标记物，从而发现表征这些疾病的生物学特征模式，用于辅助疾病的诊断与分型。代谢产物是基因表达的最终产物，与机体生理、病理状态有密切的联系，因此，代谢组学为疾病诊断的研究提供了一种可行的方法。本文采用基于核磁共振(NMR)的代谢组学技术研究两种疾病动物模型机体的代谢变化，并初步探讨其发病机制。为了更好的从含量变化的角度了解体液中小分子代谢物的变化，本文利用1H NMR技术建立了定量测定血浆中小分子代谢物含量的方法。本文的研究工作主要包含以下几个部分：
　　 1、利用基于核磁共振和气质联用的代谢组学方法对Ⅱ型糖尿病肾病动物模型db/db小鼠的发病机制进行研究。采集血浆、尿液和肾脏组织进行1H NMR分析，建立特征代谢谱，并结合模式识别方法进行统计分析。与对照组比较，db/db小鼠肾脏提取物中乳酸、TMAO和糖等代谢物的含量显著升高，而谷氨酸、乙酸和甘氨酸的含量显著降低，缬氨酸、肌酸、尼克酰胺、苯丙氨酸和酪氨酸含量略有降低。对两组小鼠血浆的GC/TOF-MS检测数据的多元统计分析结果显示，两组小鼠的代谢差异主要表现在乳酸、尿素、磷酸、葡萄糖、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、硬脂酸、软脂酸及11-顺-十八碳烯酸等代谢产物含量的变化上。结果表明db/db小鼠由于其常染色体隐性遗传的瘦素受体基因缺陷，导致其体内糖酵解、糖异生及其相关代谢途径异常，如：由瘦素受体基因调控的一些氨基酸代谢出现异常。
　　 2、利用1H NMR技术建立了定量测定血浆中小分子代谢物含量的方法。运用STD实验从初步选定的6种内标物中筛选出不与血浆中蛋白相结合的内标物。结果表明，这6种内标物均与蛋白有不同程度的结合。因此，从半峰宽的加宽程度及峰面积的减少程度两方面对6种内标物与蛋白的结合程度进行考察。在考察的过程中利用NMR对平移扩散的敏感性确定了定量检测的脉冲序列，并用反转恢复法测定了各小分子的驰豫时间，确定了驰豫延迟时间。并以此实验参数测定分别定量加入内标物的6种血浆待测溶液，考察6种内标物与蛋白的结合程度。结果显示，甲酸钠与血浆中蛋白结合程度最小。应用建立方法测定Ⅱ型糖尿病肾病模型db/db小鼠血浆中的酮体含量，结果表明两组小鼠血浆中酮体的量并无显著差异。
　　 3、利用基于核磁共振的代谢组学技术对不同病程的心肌梗死后慢性心衰动物模型的代谢物的变化进行研究。心组织提取物NMR结果显示，与假手术组比较，术后3w，模型组大鼠主要表现在胆碱、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白含量升高，乳酸、谷氨酰胺、磷酸胆碱、牛磺酸、肌酸、肌苷和去甲肾上腺素等代谢物的含量降低；术后6w与术后3w具有相同的表现，但不同的是除模型组大鼠低密度脂蛋白的含量又明显升高，胆碱含量升高也不如3w明显，到术后9w，胆碱含量又再次明显升高，12w时，极低密度脂蛋白含量的升高也有所缓解。结果表明术后模型组大鼠心脏提取物的1H NMR代谢谱图并没有发生明显的改变，说明心肌受损后很难恢复，其中主要表现在对心肌细胞具有生长促进作用的谷氨酰胺及对心肌细胞具有保护作用的及牛磺酸的水平一直较低。但由血浆的代谢谱图观察到明显的变化，这可能是由于心脏受损后，血浆代谢水平虽受到影响，但由于机体的系统应激反应，使血浆的代谢水平有一定程度的恢复。