β-连环蛋白在TNF-Α和Fas诱导急性肝损伤中的双重作用机制研究

摘要

研究背景和目的:
　　 急性肝功能衰竭是一种常见的临床危重症，常导致多器官功能衰竭，在全世界范围内有极高的致死率。临床上对于急性肝损伤的治疗缺乏特异性治疗手段，预后不理想。尽管原位肝移植是目前治疗急性肝损伤的最有效手段，但是由于供肝来源短缺、手术风险高、费用昂贵，且术后需长期服用免疫抑制剂，也导致大部分患者无法接受肝移植治疗。
　　 急性肝衰竭的发生机制主要包括毒性物质直接损伤细胞器引发细胞凋亡导致原发性肝损伤，以及肝毒性物质刺激免疫系统活化引起继发性肝损伤。因此，通过减轻细胞凋亡可作为治疗急性肝损伤的新途径。脂多糖(LPS)和D-半乳糖胺(GalN)联合使用广泛用于诱发小鼠急性肝损伤模型。TNF-α是在GalN/LPS模型中导致肝细胞凋亡的最重要因子。Fas诱导的肝细胞凋亡在免疫介导的肝脏疾病中起重要作用， Fas抗原在肝细胞内高表达，因而肝细胞对Fas诱导的肝损伤十分敏感。给予小鼠注射抗Fas抗体(Jo2)会产生致死性肝损伤。
　　 β-连环蛋白(β-Catenin)是经典Wnt信号通路中的关键蛋白，调节调节细胞的生长、增殖、分化以及凋亡。Wnt/β-Catenin信号通路的异常改变，尤其是β-Catenin的持续活化在多种肿瘤中都有发生，包括原发性肝癌。β-Catenin对细胞凋亡的调节作用十分复杂，在本研究室前期工作中发现，肝细胞特异性敲除β-Catenin小鼠对GalN/LPS诱导的肝损伤敏感性降低，而对Jo2诱导的肝损伤反应加重。β-Catenin在两种肝毒性药物诱导肝损伤过程中发挥双重作用的机制还不清楚。
　　 本课题研究将利用肝细胞特异性β-Catenin敲除小鼠以及过表达β-Catenin的Hepa1-6细胞系从体内外两方面对β-Catenin在急性肝损伤中的作用进行再一步验证，并探讨其发挥双重作用的机制。
　　 材料和方法:
　　 1.繁育肝细胞特异性敲除β-Catenin小鼠，小鼠的基因表型通过PCR验证;
　　 2.分别通过腹腔注射GalN/LPS和Jo2，建立小鼠肝损伤模型，处理6hr后收集肝脏标本;
　　 3.使用TUNEL法检测肝细胞凋亡，Western blot检测肝细胞凋亡相关蛋白PARP和Caspase3;
　　 4.应用si-RNA技术沉默Hepa1-6细胞中β-Catenin表达，沉默效率通过qRT-PCR和western blot检测。应用CCK-8检测沉默β-Catenin后细胞对TNF-α和Jo2的细胞毒性作用;
　　 5.应用免疫组化方法检测肝组织p65核转位，报告基因检测Hepa1-6细胞中NF-κB转录活性;
　　 6.应用qRT-PCR方法检测NF-κB下游靶基因SOD2和A20表达;
　　 7.应用免疫共沉淀方法检测β-Catenin和p65结合程度;
　　 8.含突变β-Catenin的腺病毒S37A用于感染Hepa1-6细胞，建立过表达β-Catenin的Hepa1-6细胞。过表达效率通过western blot，报告基因和qRT-PCR检测;
　　 9.细胞免疫荧光检测过表达β-Catenin后p65核转位情况;
　　 10.应用MDA试剂盒检测过表达β-Catenin后Hepa1-6对TNF-α诱导的氧化应激的作用;
　　 11.qRT-PCR和Western blot检测肝组织中Fas的表达情况。
　　 12.应用GraphPad Prism5.0统计软件对结果进行统计分析。
　　 结果:
　　 1.肝细胞特异性敲除β-Catenin减轻GalN/LPS诱导的肝细胞凋亡。Hepa1-6细胞干扰β-Catenin表达后TNF-α诱导的肝细胞死亡减少，而过表达β-Catenin后肝细胞死亡增多。
　　 2.β-Catenin通过与NF-κB结合，影响NF-κB的转录活性。受GalN/LPS刺激后，肝细胞特异性敲除β-Catenin小鼠肝细胞中p65入核增加，下游靶基因A20和SOD2表达增加。Hepa1-6细胞过表达β-Catenin后p65入核减少。
　　 3.肝细胞特异性敲除β-Catenin通过NF-κB加重GalN/LPS诱导的氧化应激反应。Hepa1-6细胞过表达β-Catenin后TNF-α诱导的氧化应激减弱。
　　 4.β-Catenin与NF-κB结合影响Fas表达。肝细胞特异性敲除β-Catenin小鼠肝细胞Fas表达增加，肝脏对Jo2刺激的敏感性增加，肝损伤加重，细胞凋亡增加。
　　 结论:
　　 本研究从动物和细胞水平证明β-Catenin在TNF-α和Fas所致的急性肝损伤中起不同作用。β-Catenin能够加重由TNF-α诱导的肝细胞凋亡，这主要是通过β-Catenin同NF-κB结合，抑制了其转录活性所致。此外，β-Catenin还可加重TNF-α诱导的氧化应激。由于Fas的表达也受NF-κB调控，肝细胞特异性敲除β-Catenin小鼠Fas表达增高，因而加重了Jo2诱导的肝损伤。β-Catenin通过与NF-κB的相互作用调节TNF-α和Fas诱导的急性肝损伤。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一部分 β-连环蛋白在TNF-α和Fas诱导急性肝损伤中双重作用机制研究

一、前言

二、试剂和仪器

三、实验方法

四、结果

五、讨论

六、结论

参考文献

第二部分 肝内胆管细胞癌外显子组单核苷酸多态性及短插入缺失的检测

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢