不同浓度的肿瘤坏死因子-α在急性肝损伤中的双重作用及机制研究

摘要

目的:
　　急性肝损伤是临床上较为常见的一种疾病，发病急、进展快、病情重是其特点，因此亟需明确诊断和治疗。它是介于恶化和康复转归的一种特殊临界状态，如果治疗及时，肝损伤很可能得以控制，并逐渐转愈;反之，则可能恶化，甚至转变为肝衰竭，严重危害健康。急性肝损伤可由多种疾病发展而来，如病毒性肝炎、药物性肝损伤、肝切除、肝移植、内毒素性肝损伤、肝缺血再灌注等。这些疾病通常会引起肝细胞血流的改变，进而造成不同程度的肝细胞缺氧，从而引起肝组织的损伤。
　　炎症微环境对组织损伤的发生发展具有重要的作用。而基于对调控炎症微环境治疗损伤性疾病越来越受到重视。急性肝损伤的发病机制极其复杂，其病情的发生和发展和炎症微环境的改变密切相关。早期阶段，肝组织内的库普弗细胞(Kupffer细胞)和巨噬细胞被激活后释放活性氧(reactive oxygen species，ROS)和一些炎症因子，如白介素类和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)。其中TNF-α在调节急性肝损伤过程中发挥着重要的作用。
　　TNF-α是一种具有多态性的细胞因子，能调节炎症、细胞凋亡、新陈代谢等。TNF-α的这些生物活性和其重要的调节功能，与急性肝损伤的发生发展密切相关。研究表明在急性肝损伤的发生发展过程中，TNF-α大量生成并启动和调节其它炎症因子的生成;同时TNF-α快速进入损伤的肝细胞中，诱导启动核转录因子kappa B(nuclear factor-κB，NF-κB)的信号通路的表达，共同参与肝细胞的修复过程。然而，有一些文献报导TNF-α在急性肝损伤过程中，加重损伤的恶化。它通过激活肝细胞内的一系列信号通路，最终启动凋亡程序加速肝细胞的死亡。另外有文献报导临床上患者血清中TNF-α升高与病情恶化的程度呈正相关性。
　　尽管目前对TNF-α的研究有着比较深入的了解，但是对于TNF-α在急性肝损伤的具体作用尚不明确。基于上述研究背景，我们实验对此进行了深入研究。首先制备了四氯化氮（Carbon tetrachloride，CCl4）皮下注射诱导大鼠急性肝损伤模型;并应用不同剂量的TNF-α抑制剂TNFR2融合蛋白变异体(TNFR2-Fc variants，TNFR2-Fcv，是一种基因合成的可溶性蛋白，能与TNF-α结合并抑制其活性)来观察不同浓度的TNF-α对急性肝损伤的作用，并探索可能的机制。
　　方法:
　　(1)急性肝损伤模型的制备:CCl4溶解在玉米油中，配制成40％的浓度。先将TNFR2-Fcv溶液腹腔注射到不同分组的雄性SD大鼠体内。15分钟以后，再将1ml/kg的CCl4皮下注射到相应组的大鼠体内。24小时以后，大鼠全部被处死，收集血液和分离新鲜的肝组织，用于后续的实验。
　　(2)实验分组及处理:将90只体重在200至210g之间的雄性SD大鼠，随机分为9组，平均每组10只。这些大鼠分别予以CCl4(-)+0mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(-)+8mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(+)+0mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(+)+0.25mg/kgTNFR2-Fcv、CCl4(+)+0.5mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(+)+1mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(+)+2mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(+)+4mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(+)+8mg/kgTNFR2-Fcv处理;同时我们采用TNF-α-/-大鼠给予1 ml/kg的CCl4皮下注射并将这些处理组的大鼠放置在SPF级动物房饲养。辅以25±3℃的室温下，12小时昼夜交替光照，并配以标准的饲料和清洁的饮水。
　　(3)血清TNF-α水平的检测:用ELISA检测分析不同剂量的TNFR2-Fcv作用于急性肝损伤大鼠后，血清中TNF-α的浓度，以明确体内不同浓度的TNF-α对急性肝损伤的作用。
　　(4)肝损伤的检测:从血液中析出血清，在自动分析仪中检测各组血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)和谷草转氨酶(Aspartate transaminase，AST)的水平。将肝组织石蜡包埋后制成组织切片，HE染色分析各组肝组织切片的脂肪变性程度;免疫组化技术和Tunnel试剂盒检测组织切片中Cleaved-caspase3的表达和肝细胞凋亡的水平，判断各组肝损伤的程度。
　　(5)炎症因子水平的检测:实时定量PCR(Real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测急性肝损伤过程中，体内不同浓度TNF-α对炎症因子如IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β和IFN-γ等的表达影响。
　　(6) NF-κB信号通路及抗凋亡基因的检测:Western-Blotting检测不同浓度的TNF-α在急性肝损伤过程中NF-κB信号通路的表达包括IκBα(inhibitor of NF-kappaB-α)、p-IκBα(Phospho-IκBα)和NF-κB-p65的表达。以及RT-PCR和Western-Blotting检测相关抗凋亡基因的表达如BCL-2(B-cell leukemia lymphoma2)、BCL-XL(B-celllymphoma-extra large)、XIAP(X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein)，和FHC(Ferritinheavy chain)。
　　(7)统计学分析:数据结果采用统计软件SPSS20.0进行统计分析，各组之间的均数标准误采用方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）进行检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，两组之间的差别采用Student-T检验，P＜0.05有统计学差异。
　　结果:
　　(1)在CCl4诱导的大鼠急性肝损伤模型中，血清TNF-α的浓度随着TNF-α抑制剂TNFR2-Fcv剂量的增加而逐渐下降，呈明显的相关性。
　　(2)在CCl4诱导的大鼠急性肝损伤模型中，血清ALT和AST明显上升，即ALT:从36.75±8.73U/L上升至193.27±14.26 U/L; AST:从150.86±12.34 U/L上升至253.79±12.90U/L，p＜0.01。HE染色发现肝组织中有大量的脂肪变性，同时免疫组化染色Cleaved-caspase3阳性的细胞数量明显增多、Tunnel凋亡试剂染色发现凋亡的肝细胞数目增多和Western-Blotting检测凋亡抗体表达增强。
　　(3)在正常大鼠中，无论TNF-α抑制剂TNFR2-Fcv剂量如何改变，血清ALT和AST水平基本不变，基本处于正常范围之内。而在CCl4诱导大鼠的急性肝损伤模型中，随着TNFR2-Fcv的剂量从0mg/kg逐渐递加到8mg/kg时，体内TNF-α水平逐渐下降，血清ALT和AST水平的变化呈明显的“V”字型改变，即TNFR2-Fcv从0mg/kg增加至1mg/kg时，血清ALT和AST的值逐渐下降(P＜0.01); HE染色发现肝细胞脂肪变性的程度减轻;免疫组化和Tunnel检测到凋亡的肝细胞数目明显减少(P＜0.05)。然而，随着TNFR2-Fcv的剂量进一步加大，从1mg/kg增加至8mg/kg时，TNF-α的浓度继续降低（至8mg/kg时，TNF-α接近于0pg/ml），血清ALT和AST的值反而逐渐上升，甚至在8mg/kg时，ALT和AST水平较0mg/kg时要高(P＜0.05); HE染色发现肝细胞脂肪变性的程度反而加重;免疫组化和Tunnel检测到凋亡的肝细胞数目也大幅度增多(P＜0.05)。
　　(4)在TNF-α-/-的大鼠中，CCl4诱导急性肝损伤时，血清ALT和AST水平较野生型正常大鼠的明显升高(P＜0.01); HE染色观察到单视野肝脂肪变性十分严重。
　　(5) RT-PCR的结果提示在急性肝损伤过程中，随着TNFR2-Fcv剂量的增加，TNF-α浓度逐渐下降，促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和IFN-γ水平逐渐下降，而抑炎因子IL-4的水平反而逐渐上升。
　　(6) Western-Blotting和RT-PCR实验结果表明在急性肝损伤过程中随着TNF-α浓度逐渐下降，NF-κB信号通路基因p-IκBα和NF-κB-p65的表达以及抗凋亡基因包括Bcl-XL、FHC、XIAP和Bcl-2的表达也逐渐下降。
　　结论:
　　(1) TNF-α在调节急性肝损伤过程中发挥着重要的作用，适当地降低体内TNF-α浓度可有效地缓解肝损伤，然而，过度地降低TNF-α浓度反而会加重肝损伤。
　　(2) TNF-α的损害和保护的双重作用始终贯穿在急性肝损伤的发生和发展过程。其浓度与主要发挥的效应密切相关。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

第一部分 不同浓度的TNF-α在急性肝损伤中的作用及结果分析

前言

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分 TNF-α在急性肝损伤中的双重作用的结果分析及机制探讨

前言

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

附录

综述 肿瘤坏死因子在肝损伤中的作用机制的研究进展

参考文献

个人简历、在学期间发表论文与研究成果

致谢