孤束核中血管紧张素1-7通过Mas受体/PI3K/Akt通路上调一氧化氮释放

摘要

[研究目的]
　　 高血压是人类多发病。《2012年世界卫生统计》(World Health Statistics2012by World Health Organization)报告指出全球三分之一成年人患有高血压，这种病症的死亡人数约达中风和心脏病所导致的总死亡人数的一半。关于原发性高血压发病机制的研究一直是医学研究的重点内容。大量研究数据显示，肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)的异常与高血压病的发生、发展与预后有着十分密切的关系。血管紧张素1-7[Angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)]是RAS中的新成员。Ang-(1-7)可由血管紧张素1(AngiotensinⅠ，AngⅠ)和血管紧张素2(AngiotensinⅡ，AngⅡ)在血管紧张素转化酶(Angiotensin-convertion enzyme，ACE)和血管紧张素转化酶2(Angiotensin-convertion enzyme2，ACE2)的催化作用下生成。Ang-(1-7)是由七个氨基酸组成的多肽，通过与细胞膜表面特异性受体Mas受体(Mas recptor, MasR)结合，产生降低血压、减缓心律、降低交感神经活性、抗心肌纤维化与重构等心血管保护效应，与AngⅡ的作用相拮抗，从而维持心血管系统的稳态。高血压病状态下，Ang-(1-7)和AngⅡ平衡失调，Ang-(1-7)活性下降。因此，纠正Ang-(1-7)和AngⅡ的失衡状态，增强Ang-(1-7)的功能是高血压病防治的有效策略。
　　 中枢神经系统心血管调节中枢对血压、心率等心血管功能具有重要调节作用。心血管调节中枢主要位于脑干，其中较为重要的核团有孤束核(Nucleus ofsolitary tract，NTS)、头端延髓腹外侧区（Rostral ventrolateral medulla, RVLM）和尾端延髓腹外侧区（Caudal ventrolateral medulla, CVLM）等。NTS是心血管调节的第一站，具有重要的心血管调节效应。NTS接收来自外周动脉压力感受器的神经传入，并对外周信号进行初步整合，发出神经纤维投射到CVLM，通过CVLM中γV氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)能神经元的抑制性中转，最终调节RVLM神经元活性，RVLM是控制交感神经活动的中枢区域。同时，NTS神经元通过兴奋性纤维投射到迷走神经中枢（如疑核等），调节迷走神经活动。NTS在维持基础血压、交感神经紧张性输出，介导压力反射等心血管功能调节中具有关键作用，NTS功能异常与高血压病的发生发展具有密切的关系。中枢神经系统中存在完整的RAS，即中枢神经系统内含有生成RAS所有成分所需的底物和酶。外周组织器官生成的Ang-(1-7)不能透过血脑屏障，因而中枢神经系统内局部生成的Ang-(1-7)发挥了重要的心血管调节作用。
　　 无论外周还是中枢神经系统，一氧化氮NO都是一个重要的信使分子，参与调节心血管、免疫等系统的功能。外周循环系统的研究已证实，Ang-(1-7)通过一氧化氮(Nitric oxide，NO)介导发挥作用。另有研究发现，NTS中NO通过调节特定神经元的活性发挥重要心血管调节效应。但中枢神经系统Ang-(1-7)的作用及机制尚不明了。NTS中Ang-(1-7)发挥心血管调节效应是否通过NO介导？其具体信号通路又是什么？本课题的研究目的在于深入探讨Ang-(1-7)在NTS发挥心血管调节功能的信号通路。
　　 [研究方法]
　　 实验使用300-350g雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，整体动物水平观察NTS局部给予Ang-(1-7)对大鼠血压、心率、肾交感神经活动及动脉压力感受性反射等指标的影响;预处理一氧化氮合酶(Nitricoxide synthase，NOS)抑制剂L-NAME后，观察Ang-(1-7)的效应是否被阻断，以判断Ang-(1-7)发挥作用是否依赖于NOS;同时预处理Ang-(1-7)，观察其对L-NAME心血管效应的影响;使用相应的分子生物学方法检测大鼠NTS急性给予Ang-(1-7)后的NO含量及NOS活性，并使用工具药和小RNA干扰技术（siRNA interferring technology）等方法进一步研究其作用机制;调研文献后选出MasR/PI3K/Akt通路作为研究对象，使用Western Blot检测大鼠NTS急性给予Ang-(1-7)后Akt、nNOS和eNOS的磷酸化水平，给予MasR阻断剂(A779)、PI3K抑制剂(LY294002)和Akt抑制剂(TCN)后Ang-(1-7)的上述磷酸化效应是否被消除;同时在整体动物水平，研究给予上述通路靶点蛋白阻断剂或抑制剂后，Ang-(1-7)的心血管效应是否被消除;使用小RNA干扰技术特异性干扰大鼠NTS区域神经细胞PI3Kp110δ，亚基的表达，15天后Western Blot检测大鼠NTS急性给予Ang-(1-7)后NO含量及Akt、nNOS和eNOS的磷酸化水平，进一步验证PI3K在信号通路中的位置;使用免疫荧光共定位方法观察NTS中是否存在MasR与nNOS的共表达，从组织分布上确定两者存在相互作用的可能性。
　　 [结果]
　　 一、 NTS局部注射Ang-(1-7)对心血管活动的影响
　　 NTS单侧微量注射Ang-(1-7)(25pmol/50nl)可降低血压（-12.8±1.8 mmHg）、减缓心率(-22.0±3.1 beats/min)和降低肾交感神经活动(-15.8±2.0％);NTS双侧微量注射Ang-(1-7)(25pmol/50nl)可显著增强动脉压力感受性反射(ABR)（从1.0强动脉压升高至1.8动脉压力感受性反射ats/mi。
　　 二、 NTS预处理L-NAME可改变局部注射Ang-(1-7)对心血管活动的影响
　　 溶剂对照组大鼠NTS局部注射Ang-(1-7)可降低血压、减慢心率和下降肾交感神经活动;预处理NOS阻断剂L-NAME后，与溶剂对照组相比，Ang-(1-7)的降压幅度减小，减慢心率的作用被逆转，降低的肾交感神经活动效应也被逆转（P＜0.05）。
　　 三、 NTS局部注射Ang-(1-7)能够增强L-NAME升血压、加快心率和升肾交感神经活动的效应，Ang-(1-7)的这一效应可被MasR阻断剂和PI3K抑制剂消除
　　 NTS预处理溶剂(人工脑脊液，aCSF)后给予L-NAME可产生升血压、加快心率和升肾交感神经兴奋性的作用;与预处理溶剂组相比，预处理Ang-(1-7)可使L-NAME升血压、加快心率和增强肾交感神经活动的作用加强(P＜0.05);预处理MasR阻断剂A779可减弱Ang-(1-7)对L-NAME的易化作用(P＜0.05）;预处理PI3K抑制剂LY294002可完全消除Ang-(1-7)对L-NAME的易化作用(P＜0.05）。与溶剂对照组相比，各组大鼠NTS局部注射L-NAME前血压、心率等指标均无显著性差异（P＞0.05）。
　　 四、 Ang-(1-7)能够上调NO含量和NOS活性，这一效应通过MasR/PI3K/Akt通路介导
　　 与溶剂对照组相比，Ang-(1-7)能够增加NO的生成（平均升高34％，P＜0.05），并提高总NOS的活性（平均升高38％，P＜0.05）。使用A779、LY294002和TCN能够阻断Ang-(1-7)的上述效应(P＜0.05）。与溶剂对照组相比，单独给予A779、LY294002或TCN不影响NO含量（P＞0.05）。
　　 五、 Ang-(1-7)可刺激Akt和NOS磷酸化，这一效应通过MasR/PI3K/ Akt通路介导
　　 Western blot结果显示，与溶剂对照组相比，Ang-(1-7)能够增加AktSer473、nNOS Ser1416和eNOS Ser1177相应位点的磷酸化水平(P＜0.05)。与Ang-(1-7)组相比，使用A779、LY294002能够消除Ang-(1-7)对Akt的磷酸化效应(P＞0.05)，使用A779、LY294002或TCN能够消除Ang-(1-7)对nNOS/eNOS的磷酸化效应(P＞0.05）。
　　 六、慢病毒转染干扰PI3K表达后，Ang-(1-7)增加Akt、nNOS和eNOS磷酸化的效应被抑制，进而导致Ang-(1-7)增加NO生成的效应被抑制
　　 PI3K siRNA干扰慢病毒(LenVi-PI3K KD)或空载慢病毒(LenVi-GFP)局部感染NTS，15天之后NTS急性给予Ang-(1-7)进行后续检测。Western blot结果显示，NTS局部感染LenVi-GFP后，与溶剂对照组相比，Ang-(1-7)能够增加AktSer473、nNOS Ser1416和eNOS Ser1177位点的磷酸化水平(P＜0.05)，进而增加NO含量(P＜0.05); NTS局部感染LenVi-PI3K KD后，与溶剂对照组相比，Ang-(1-7)不能增加Akt Ser473、nNOS Ser1416和eNOS Ser1177相应位点的磷酸化水平(P＞0.05)，也不能增加NO含量(P＞0.05)。
　　 七、 MasR和nNOS免疫荧光共定位
　　 免疫荧光共定位结果显示，MasR(绿色荧光)和nNOS(红色荧光)可在同一NTS神经细胞内共表达，提示nNOS与Ang-(1-7)/ MasR之间可能存在密切联系。
　　 [结论]
　　 Ang-(1-7)上调NTS中NO生成，进而产生降低血压、减缓心率、降低交感神经活性等心血管效应，这一效应是通过MasR/PI3K/Akt/NOS通路介导的。

目录

声明

摘要

英文缩写对照表

前言

材料与方法

实验结果

一、Ang-(1-7)能够降低血压、心率和肾交感神经活动，并增强动脉压力感受性反射

二、NOS阻断剂能够阻断Ang-(1-7)的心血管效应

三、Ang-(1-7)能够增加NOS抑制剂的升血压、心率和肾交感神经活动的心血管效应

四、Ang-(1-7)能够增加NO含量和NOS活性，这一效应通过MasR/PI3K通路介导

五、Ang-(1-7)能够刺激NOS磷酸化，这一效应通过MasR/PI3K/Akt通路介导

六、Ang-(1-7)刺激PI3K表达，这一效应通过MasR介导

七、Ang-(1-7)刺激Akt磷酸化，这一效应通过MasR/PI3K通路介导

八、慢病毒感染干扰PI3K表达效果验证

九、慢病毒感染干扰PI3K表达后，Ang-(1-7)增加PI3K、Akt、eNOS和nNOS和磷酸化的效应被抑制

十、慢病毒感染干扰PI3K表达后，Ang-(1-7)增加NO生成的效应被抑制

十一、MasR和nNOS的免疫荧光共定位

讨论

课题创新点与不足之处

结论

参考文献

综述

在读期间科研收获

致谢