佐剂性关节炎大鼠滑膜中MyD88的表达及青藤碱的影响

摘要

背景:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以慢性破坏性多关节病，是一种由抗原驱动、与遗传相关的多因素参与的自身免疫性疾病，其发病的中心环节主要围绕感染和自身免疫反应，RA以多关节的肿胀和慢性疼痛为主要临床表现，慢性关节炎症导致滑膜增生，软骨的退化和骨质破坏是其重要的病理特征。Toll样受体(Toll-like recepter，TLR)家族在自身免疫性疾病和炎症性疾病中起重要作用。TLRs主要表达于巨噬细胞和树突状细胞，直接参与先天性免疫应答，并TLRs通过识别相关的病原刺激促炎性细胞因子表达并上调共刺激分子，从而参与适应性免疫应答。髓样分化因子88由TLRs(TLR3除外)激活，是TLRs信号转导通路中最主要的接头蛋白。MyD88是在启动先天性免疫应答和适应性免疫应答方面有不可忽视的作用。现有研究显示TLRs在类风湿关节炎发病及进展中发挥重要作用，而髓样分化因子MYD88作为TLRs通路中的核心蛋白，其在类风湿关节炎发病中的作用也日渐突出。中药青风藤为防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤茎，味苦，性平，归肝、脾经，具有祛风湿、通经络、镇痛之功效，用于治疗风湿痹痛、关节肿痛等。盐酸青藤碱(Sinomenine,8-didehydro-4-hydroxy-3,-dime-thoxy-17-methylmorphinan-6-one,C19H23NO4)是从中药青风藤中提取的生物碱单体，青藤碱具有肯定的抗炎、免疫抑制、镇痛、抑制软骨破坏等作用，为植物中很强的组织胺释放剂，临床中广泛的应用于治疗类风湿关节炎。多种炎性细胞因子参与了RA的发病和进展，如TNFα、IL-1、IL-6等促炎症因子，可以参与免疫细胞活化及诱导金属蛋白酶产生，促进关节破坏。研究结果表明SN改善RA的滑膜病理改变。由于SN可以降低佐剂性关节炎大鼠滑膜中炎性细胞因子表达以及抑制人滑膜细胞中T细胞的活化和增殖，而MyD88不但在促进炎性细胞因子过表达中发挥重要作用更促进T细胞增殖和启动适应性免疫应答。在前期发现SN对滑膜细胞的抗炎作用的基础上，我们提出:SN可以抑制RA患者滑膜炎性细胞因子表达并且抑制T细胞诱导的适应性免疫应答，其具体机制可能与抑制MyDS8通路的激活，下调其下游相关因子的过表达相关。所以，我们采用佐剂性关节炎大鼠模型设计实验，观察SN对实验大鼠关节疼痛、炎症，滑膜病理改变，滑膜炎性细胞因子TNFα表达的影响;同时，观察SN对大鼠滑膜中MyD88的影响。为SN治疗RA提供动物实验依据。
　　 目的:近来，围绕髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor88，MyD88)究在类风湿关节炎的发病与进展中受到越来越多的关注。而青藤碱(Sinomenine，SN)在类风湿关节炎中的治疗作用也越来越受到认可。该实验观察青藤碱对佐剂性关节炎大鼠的关节疼痛、病理改变和滑膜炎症的影响青藤碱对大鼠关节滑膜MyD88的影响，从而探讨青藤碱对关节炎的治疗作用及作用机制。
　　 方法:1、SD大鼠随机分为正常组，模型组，SN组和甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠均于右后足趾皮内注射完全弗氏佐剂以诱导佐剂性关节炎。造模以及用药前后测量大鼠关节疼痛的变化。分别于造模后d8、d16、d24、d30于测量大鼠行为学特征（机械痛、热痛）。造模d30处死大鼠取其滑膜。2、行滑膜常规病理HE染色检查。3、ELISA法检测各组大鼠滑膜中炎性因子TNFα的表达。4、采用Western Blot法和免疫组化法测定各组大鼠滑膜中MyD88的表达和分布的影响。
　　 结果:1、SN对佐剂性关节炎大鼠的热痛和机械痛的影响(1)热痛:造模第8天及第16天，正常组大鼠热痛阈值与其他各组相比均有明显差异，SN组、MTX组分别与模型组比较未见明显差异。而第24天及第30天，SN组、MTX组大鼠疼痛阈值与模型组大鼠疼痛阈值相比均有明显升高。(2)机械痛:造模后第8天，正常组大鼠机械痛阈值与其他各组相比均有明显差异，其他各组间无差异。第16天，正常组大鼠机械痛阈值与其他各组比仍差异明显，MTX组与模型组比较明显降低。第30天，SN组与MTX组大鼠机械痛阈值与模型组相比均有降低。2、SN对佐剂性关节炎大鼠滑膜病理改变的影响根据病理图片显示，模型组大鼠炎性细胞浸润及滑膜增生较正常组明显增加，而SN组及MTX组大鼠滑膜细胞增生及炎性细胞浸润较模型组明显改善。3、SN对佐剂性关节炎大鼠滑膜中炎性细胞因子的表达的影响模型组细胞因子TNFα的表达较正常组显著升高，而SN组和MTX组细胞因子TNFα表达与模型组相比显著均降低。4、SN对大鼠滑膜MyD88的表达的影响(1)Western Bolt法分析各组大鼠滑膜MyD88的蛋白表达水平。结果显示，SN可以显著降低佐剂性关节炎大鼠滑膜中MyD88的表达。(2)大鼠滑膜组织切片免疫组化染色显示:模型组中MyD88的染色与正常组相比更为明显增多，多分布于炎症细胞中，且染色深。SN能减少佐剂性关节炎大鼠滑膜中的MyD88染色。
　　 结论:1、SN改善佐剂性关节炎大鼠关节疼痛。2、SN减轻佐剂性关节炎大鼠关节滑膜炎性细胞浸润、滑膜细胞增生。3、SN抑制佐剂性关节炎大鼠关节滑膜组织中炎性细胞因子TNFα的表达。4、MyD88在佐剂性关节炎大鼠关节的滑膜中高表达，SN抑制佐剂性关节炎大鼠关节滑膜中MyD88的表达。5、SN对大鼠佐剂性关节炎具有肯定的治疗作用。其作用机制可能与降低大鼠滑膜中MyD88水平进而抑制滑膜组织中炎性因子的表达有关。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

实验材料

一、仪器与设备

二、药物与试剂

三、实验动物

实验方法

一、造模方法

二、分组及给药方法

(一)造模及给药

(二)大鼠给药及方法

三、指标检测及方法

(一)大鼠关节行为学测定

(二)大鼠滑膜HE染色过程

(三)大鼠滑膜MyD88免疫组织化学染色过程

(四)大鼠滑膜的总蛋白提取

(五)Western Blot检测过程

(六)ILISA检测过程

四、统计方法

实验结果

一、SN改善大鼠关节疼痛

(一)SN对大鼠机械痛的影响

(二)SN对大鼠热痛的影响

二、SN改善大鼠滑膜病理改变

三、SN对大鼠滑膜炎性因子TNFα表达的影响

四、SN降低关节炎大鼠滑膜中MyD88蛋白的表达

五、免疫组化分析SN对关节炎大量滑膜MyD88蛋白的影响

讨论

结论及研究意义

一、结论

二、研究意义

参考文献

附录

综述

硕士在读期间发表论文情况

致谢