滑膜间充质干细胞向纤维软骨分化的条件及分子机制研究

摘要

目的:探索滑膜间充质干细胞(SMSCs)稳定地向纤维软骨分化的充分必要条件，并在体外实验中重复这一过程;进而初步探索这一过程调控的分子机制。方法:通过贴壁法和有限稀释技术得到SMSCs，通过形态学、超微结构、分子表型、细胞代谢动力学、多向诱导分化等方法鉴定SMSCs并验证其稳定性、安全性、成软骨能力、细胞活性和三向分化潜能等生物学特征。通过综述文献、模拟体内环境等方法，经过预实验筛选后，使用L60(212)正交试验探索SMSCs向纤维软骨分化的充分必要条件;正交试验以纤维软骨生成率为因变量，使用RT-PCR方法检测纤维软骨细胞的基因表达，使用甲苯胺蓝等特异染色手段检测软骨特异性分子的表达，以计算软骨生成率。通过反复试验和比对探索出SMSCs向纤维软骨分化并稳定表达的最佳条件后，使用基因芯片的方法检测这一过程差异表达的基因。基因芯片的8697个目的基因来源于文献综述，2153个基因序列来源于expressed sequence-tag(EST) library，6，544是根据NCBI databaseGenebank数据库证实的基因构建，一些基因的开放性阅读框太短，无法用于基因芯片，最终用于基因芯片检测的基因有8605个。差异表达的基因再使用半定量RT-PCR的方法进一步验证。使用Quackenbush的方法进行数据标准化和背景噪音的消除，使用Eisen的方法进行基因芯片数据分析，2倍表达差异作为差异表达的下限。此后进行基因功能分析。最后，针对基因芯片的表达结果和实验中涉及的调控条件推论TGFβ-TGFβ receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路参与SMSCs成纤维软骨过程中的调控，使用RT-PCR和Western-Blotting的方法在基因水平和蛋白水平证实纤维软骨基因和调控因子间的关系，使用软骨特异性染色和特异分子的染色鉴定这些分子在SMSCs诱导分化后的高表达。结果:SMSCs具有稳定、安全、成软骨能力强、细胞活性好、取材方便等特征。在SMSCs成纤维软骨过程中TGFβ1，BMP7，ASA，bFGF, IGF是最重要的调控因子，通过对这些因子的剂量和时序表达的改变，可以显著的影响SMSCs成纤维软骨的过程。其他细胞因子与前述因子存在交互，调控显著性不及前述因子。除细胞因子外，机械环境氧浓度等亦是重要的调控作用，通过合理配置这些调控作用，能够得到稳定的纤维软骨转化率。基因芯片证实，SMSCs成软骨过程中，目标基因中1361基因差异表达，这些基因并不是持续高表达，而是随时间变化不断调整表达丰度。聚类分析显示，分化第21天的细胞与原始SMSCs的基因相似程度较高，而分化3、7、14天的细胞更加相似。主要功能基因的分析显示无论是SMSCs原代细胞还是成纤维软骨诱导后的细胞其增殖相关基因表达增高显著，大部分的高表达基因在这一过程中的作用还不是非常清楚。TGFβ-TGFβ receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路是两条重要的调控通路，糖浓度和机械环境对SMSCs成纤维软骨的调控通过前述通路实现。许多调控通路中涉及大量未知的调控因子和旁路，即使是已知的通路中仍存在未知的作用。结论:SMSCs是理想的半月板组织工程种子细胞来源;合理的培养条件能得到SMSCs稳定向纤维软骨细胞分化的支架模型;这一过程涉及存在大量差异表达的基因且多数功能不清楚值得深入探索;TGFβ-TGFβ receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路是两条重要的基因调控通路，糖浓度和机械环境对SMSCs成纤维软骨的调控通过前述通路实现;调控通路和基因表达之间关系复杂，即有调控通路下游基因的差异表达，又存在调控通路本身基因的差异表达，还有已表达的基因在小干扰RNA作用下降解等问题，深入研究SMSCs成软骨过程的分子机制对体外构建有生物学功能的半月板组织至关重要。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 兔滑膜间充质干细胞的分离纯化与鉴定

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 滑膜间充质干细胞成纤维软骨条件探索

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 滑膜间充质干细胞成软骨过程基因表达

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分 滑膜间充质干细胞成软骨过程调控作用的初步探索

前言

材料与方法

结果

结论

讨论

参考文献

全文总结

半月板组织工程重建研究进展

在读期间的科研成果

致谢

附录