红花离体再生体系的建立及黄酮类生物合成途径关键酶基因的克隆与鉴定

摘要

红花（Carthamus tinctorius L.）是菊科一年或两年生草本植物，其花是传统活血化瘀中药，具有扩张冠状动脉、抗凝血、降血压、抗炎镇痛等多种药理作用，临床应用广泛。黄酮类化合物如羟基红花黄色素A、山奈酚及其苷类、槲皮素及其苷类等是红花的主要有效成分，其含量的高低直接影响红花品质的优劣。因此，克隆并鉴定红花黄酮类生物合成途径中的关键酶基因，对于阐明红花品质形成的分子机制具有重要意义，并为通过转基因技术调控红花黄酮类化合物的生物合成奠定基础。在植物体细胞转基因研究中，高效的离体再生体系是一个必要条件。本课题就红花离体再生体系的建立及黄酮类生物合成途径中关键酶基因的克隆与鉴定进行了实验探索。
　　 实验结果显示，从萌发6-8天的红花无菌苗上剪下的子叶作为外植体有较高的再生芽诱导能力，培养温度为白天24℃、晚上16℃;光照强度为9000lux;相对湿度在60％时最适合再生芽的诱导。培养基配方(14) MS0+ TDZ(12.0 mg/L)+IBA(2.5 mg/L)+2-ip(1.5 mg/L)的诱导再生率最高，达到79.1％，并且此时再生芽长势最好，重现性高，是比较理想的红花再生培养基配方。再生芽转移到MS基本培养基上能够顺利伸长，长势良好。
　　 Contig897、Contig1988、Contig2129、Contig3482、Contig3855是课题组前期筛选的红花黄酮类生物合成途径中高表达的黄烷酮-3-羟基化酶(F3H)候选基因。本实验以它们为研究对象，通过RACE扩增技术分别获得了各Contig的5’和3’端，将其进行测序和拼接后获得了各基因全长序列，并通过PCR扩增得到了5条基因全长。生物信息学分析显示，Contig897在核酸及蛋白水平上与其他植物的F3H高度同源(≥72％)，其编码的氨基酸序列与SWISS-PROT酶数据库中其他植物的F3H氨基酸序列的一致性达80.16％; Contig1988、Contig3482全长序列编码的氨基酸序列与番茄的预测黄酮醇合酶(FLS)或F3H片段序列同源性分别为64％、45％，与SWISS-PROT酶数据库中其他植物的F3H氨基酸序列的一致性分别达到74.83％、75.44％; Contig2129全长序列编码的氨基酸序列与蓖麻的预测预测FLS或F3H序列同源性为60％，与SWISS-PROT酶数据库中其他植物的F3H氨基酸序列的一致性达75.73％; Contig3855与大豆的预测FLS或F3H序列同源性为64％，与SWISS-PROT酶数据库中其他植物的F3H氨基酸序列的一致性达74.36％。
　　 随后，尝试将5条基因进行原核表达以验证其功能。PCR扩增得到了Contig897和Contig2129这两个基因用于构建原核重组质粒的特异性片段P897和P2129，序列分析显示，P897序列编码的氨基酸序列是F3H的同源序列，可以尝试进行原核表达实验。P897片段和pET-32a(+)载体经过酶切、连接反应构成重组质粒后，成功转化到BL21(DE3)pLysS原核表达宿主菌中。对不同菌液浓度、不同诱导时间的表达情况分析显示，当菌液OD600为0.6时诱导3-5h及菌液OD600为0.8时诱导3h后菌样的菌体细胞总蛋白各条带明显，是比较合适的诱导条件。
　　 本课题构建了红花离体再生体系，克隆了红花黄酮类生物合成途径中的5个关键酶基因全长并初步鉴定其功能。本研究成果为进一步阐明红花品质形成的分子机制并通过转基因技术调控红花黄酮类的生物合成奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 红花离体再生体系的建立

一、所用仪器与试剂

(一)主要实验仪器

(二)主要试剂

二、实验材料与方法

(一)供试材料

(二)培养条件

(三)实验方法

三、实验结果与分析

(一)培养无菌苗

(二)红花再生芽诱导预实验

(三)红花再生芽诱导培养基配方的优化

(四)红花再生芽的伸长

四、本章小结

第二章 基于RACE技术克隆5条红花F3H候选基因的全长

一、所用仪器与试剂

(一)主要仪器设备

(二)主要试剂

(三)常用试剂及培养基的配制

二、实验材料与方法

(一)红花花冠总RNA的提取与检测

(二)合成cDNA第一链

(三)RACE扩增各Contig的5’和3’端

(四)目的片段的检测回收与测序

(五)目的片段与T载体连接并转化到大肠杆菌中保存

(六)各基因全长序列的获得及生物信息学分析

(七)克隆各基因全长

三、实验结果与分析

(一)红花花冠总RNA的提取与检测

(二)RACE扩增获得各Contig的5’和3’端

(三)各基因全长序列的获得及生物信息学分析

(四)各基因全长的克隆

四、本章小结

第三章 目的基因的原核表达初探

一、所用仪器与试剂

(一)主要仪器设备

(二)主要试剂

(三)常用试剂及培养基的配制

二、实验材料与方法

(一)扩增目的片段

(二)所得目的片段的序列分析

(三)构建重组质粒

(四)将重组质粒转化到BL21(DE3)pLysS宿主菌

(五)诱导表达

三、实验结果与分析

(一)扩增目的片段

(二)所得目的片段的序列分析

(三)构建重组质粒

(四)将重组质粒转化到BL21(DE3)pLysS宿主菌

(五)表达产物分析

四、本章小结

第四章 研究总结

一、红花离体再生体系的建立

二、基于RACE技术克隆5条红花F3H候选基因的全长

三、目的基因的原核表达初探

四、总结与展望

综述

参考文献

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢