协同氟康唑抗耐药真菌光亲和探针的设计合成及活性研究

摘要

随着抗真菌药物的长期大量使用，真菌耐药问题也越来越严重。我们前期发现连翘酯苷A、小檗碱、黄芩素、芒果苷等化合物具有协同氟康唑抗耐药真菌作用。化合物之间具有相近的体内外药效、作用机制存相同之处;构效关系研究表明了它们有相似的药效基团。但我们对其作用靶点研究一直未获明确结果并严重制约研究的深入。 近年来，PAL-CC-ABPP(photoaffinity labeling click chemisty activity-base proteinprofiling)已经成为在天然环境中研究酶活性的重要策略。PAL-CC-ABPP技术可以在天然的生物系统内利用直接作用于活性位点的化学探针来探测相关的靶点蛋白。该类探针由活性部分、三氟甲基苯基diazirine（光亲和部分）、潜在的报告基团炔基部分、生物素-azide或罗丹明-azide部分（作为标签）四部分组成。活性部分用于识别靶蛋白，三氟甲基苯基diazirine部分在365 nm波长光照射后，可以与靶蛋白发生共价结合，然后利用潜在的报告基团炔基通过Click反应连接上标签部分，来富集、分离和提纯靶蛋白。 结合前期我们对小檗碱进行结构改造的结果，本论文围绕基于小檗碱的光亲和标记小分子探针的设计、合成及药理活性测试、靶点探测开展了以下研究工作: (1)以活性较好的胡椒乙胺类为活性基团，添加了乙二醇作为连接基团，连接潜在报告基团炔基，设计合成了化合物TPD-1和TPD-2，对其进行了活性测试，发现其具有较好的协同氟康唑（8μg/ml）抗耐药真菌的作用。 (2)以胡椒乙胺类活性较好的化合物为原型化合物，连接上光亲和标记基团三氟甲基苯基diazirine，合成化合物TPD-3，并进行活性测试，发现它也具有较好的协同氟康唑抗耐药白念珠菌活性。 (3)在以上探索的基础上，设计合成了化合物TPD-5，TPD-6，以及含有活性基团、光亲和标记基团、报告基团的化合物探针TPD-4。但活性测试结果表明，其与氟康唑(8μg/ml)联用的MIC80:64μg/ml、4μg/ml、64μg/ml，其中，TPD-5具有协同抗耐药真菌的作用。 (4)受抗真菌药物肟康唑启发，使炔基和含有光亲和部分的化合物以肟的形式连接起来，设计合成了探针化合物TPD-7，活性测试结果表明，其与氟康唑(8μg/ml)联用的MIC80为0.5μg/ml，两药合用的FICI为0.0705，证明TPD-7与氟康唑具有较好的协同作用。 (5)以小檗碱为活性部分，三氟甲基苯基diazirine为光亲和基团，炔基为潜在报告基团设计合成了探针分子TPD-8，TPD-9，与氟康唑(8μg/ml)联用时，其MIC80分别为2μg/ml，16μg/ml。活性测试表明他们具有较好的协同氟康唑抗耐药真菌作用。对其进一步优化设计合成了延长报告基团连接链的化合物TPD-10，发现其溶解性随着链的延长而降低。 (6)设计合成了探针的罗丹明-azide部分、生物素-azide部分，用于识别、捕获、富集靶蛋白。 所有合成的化合物分子均通过1H-NMR、MS确认其结构，其活性数据表明，化合物TPD-3、TPD-7、TPD-8、TPD-9均具有很好的协同氟康唑抗耐药真菌活性，其中探针TPD-7活性更优。另外，化合物TPD-8、TPD-9和小檗碱的结构极为相似，结合特异性靶点的概率更大;但是它们和小檗碱一样都含有季铵离子，考虑到该季铵离子会与多种蛋白通过离子键发生非特异性结合，导致结果复杂;因此，设计合成不含离子的胡椒乙胺类探针化合物TPD-3、TPD-7，我们可以通过两类探针捕获蛋白的生物信息比较，去除非特异结合的靶蛋白。 小檗碱具有诸多的药理作用，其在体内应有多个靶点，我们设计合成的探针分子有望用于这些靶点的发现，促进相关新药的研发。对探针结合的光照时间、结合时间和温度进行了初步的模拟实验，确定了光亲和基团光照分解时间为60 min，经MS确认了Click反应的发生，且反应条件为60℃震荡反应30 min，为进一步深入探索靶点打下了基础。 初步的药理实验是在真菌细胞裂解液提取的全蛋白中进行，探针选用化合物TPD-7、TPD-8，竞争化合物分别是化合物6-1和小檗碱，用TAMRA-azide作为标签，SDS-page结果显示，蛋白出现特异性条带，证实所合成探针用于靶点研究的可行性。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、真菌耐药性及课题组前期抗耐药真菌研究进展

二．光亲和基团用于小分子探针的研究概况

三 选题指导思想

课题设计思路

实验部分

一、实验试剂与检测仪器

二、小分子探针的设计合成

(一)、光亲和片段的合成

(二)、目标化合物的合成

(三)、化合物的理化性质与波谱数据

药理实验部分

一 目标化合物的抗耐药白色念珠球菌作用活性测试

二 小分子探针捕获靶点的初步研究

结果与讨论

参考文献

附录

在读期间发表论文和科研工作情况说明

致谢