低剂量化疗诱导的DNA损伤反应和自噬在结肠癌细胞衰老与凋亡中的作用及机制

摘要

细胞衰老是指细胞进入一种不可逆转的细胞周期停滞的生物学状态，其特征是细胞形态、基因表达谱以及染色质结构的显著改变。由于肿瘤细胞中端粒酶的活性作用使得学术界普遍认为肿瘤细胞存在衰老障碍，但是近期研究报道了一种新颖的化疗方式称之为“低剂量化疗”，其可不依赖于端粒的缩短而使得肿瘤细胞重新进入衰老程序—早熟性衰老，这种化疗方式在肿瘤治疗中扮演越来越重要的作用。 然而，衰老的细胞虽然失去了增殖分裂的能力，但是依然存活并且保持着代谢活性。因此，这种以诱导细胞衰老为目的的治疗方式可能导致一些问题的出现:1）衰老的细胞能够分泌多种具有潜在促肿瘤效应的蛋白质以及细胞因子，这些分泌物质有可能导致肿瘤周边的正常细胞发生恶性转变;2）衰老的细胞并没有被机体免疫系统立即清除，有可能重新进入细胞周期恢复增殖活性，最终导致肿瘤的复发;3）衰老的细胞一般具有拮抗凋亡的能力。因此，积极寻求一种能够将衰老的肿瘤细胞转化为凋亡状态的化疗方式对于肿瘤治疗将会有十分重要的意义。 研究证实化疗药物等可以诱发细胞自噬。自噬是细胞在应对外界刺激时利用溶酶体选择性降解自身受损的细胞器和/或长寿命蛋白从而为机体提供能量和原料的分解代谢过程，其对于维持细胞内环境的稳定性以及基因组的完整性具有重要的作用。有关自噬和衰老之间的关系以及自噬是如何调控衰老的具体机制目前尚不明确，因此需要我们进一步深入地探讨。 为了研究自噬在低剂量化疗诱导的结肠癌细胞衰老与凋亡中的作用及机制，本课题将从以下两个方面进行研究:第一部分研究低剂量化疗诱导的DNA损伤反应在结肠癌细胞衰老中的作用;第二部分研究自噬在低剂量化疗诱导的结肠癌细胞衰老与凋亡中的作用。 第一部分 研究低剂量化疗诱导的DNA损伤反应在结肠癌细胞衰老中的作用 研究结果显示，低剂量化疗药物喜树碱处理结肠癌细胞后，经典的衰老检测方法SA-β-gal染色结果显示衰老被显著诱导。Real-time PCR以及Westernblotting结果显示衰老的标志性分子p53、p21表达水平显著升高。我们初步探讨了低剂量喜树碱诱导结肠癌衰老的可能机制。低剂量喜树碱处理结肠癌细胞后，细胞免疫荧光以及Western blotting结果显示DNA损伤反应相关蛋白γ-H2AX、p-ATM、p-Chk2表达水平显著升高。为了进一步明确DNA损伤反应在衰老发生中的作用，我们使用ATM特异性抑制剂KU55933阻断DNA损伤反应的激活，SA-β-gal染色结果显示衰老显型被显著减弱，Western blotting结果也显示p53、p21表达水平显著降低。上述结果表明，低剂量化疗可激活持续的DNA损伤反应通路进而介导结肠癌细胞衰老的发生。 第二部分 研究自噬在低剂量化疗诱导的结肠癌细胞衰老与凋亡中的作用 首先我们观察低剂量化疗对结肠癌细胞自噬发生的影响。研究结果显示，低剂量喜树碱处理结肠癌细胞后，自噬相关基因Atg5、Atg7、Beclin1表达水平显著升高，自噬的底物蛋白p62表达水平显著降低，胞浆内绿色点状GFP-LC3显著增多，透射电镜下胞浆内自噬体显著增多。p-AMPK、p-TSC2表达水平显著升高，p-mTOR表达水平显著降低。结果提示低剂量化疗可能通过激活AMPK-TSC2-mTOR通路进而介导自噬的发生。 其次我们观察自噬抑制后低剂量化疗对结肠癌细胞衰老发生的影响。研究结果显示，自噬抑制剂3-MA和CQ预处理后，低剂量喜树碱处理结肠癌细胞，SA-β-gal染色结果显示衰老的发生被显著抑制。为了明确自噬对衰老发生的影响，我们运用小干扰RNA技术干扰自噬相关基因Beclin1表达。在Real-time PCR和Western blotting结果证实Beclin1的干扰效率后，低剂量喜树碱处理结肠癌细胞，SA-β-gal染色结果同样显示衰老的发生被显著抑制。我们初步探讨了自噬调控衰老发生的可能机制。研究结果显示，在3-MA和CQ以及小干扰RNA干扰自噬后，p53、p21表达水平显著降低。上述结果表明，自噬可通过调控DNA损伤反应相关蛋白p53、p21的表达进而影响结肠癌细胞衰老的发生。 最后我们观察自噬被抑制后低剂量化疗对细胞凋亡的影响。研究结果显示，在自噬抑制剂3-MA和CQ预处理后，低剂量喜树碱处理结肠癌细胞，CCK-8结果显示细胞活性显著降低，AnnexinⅤ/PI染色流式细胞仪检测结果显示细胞的凋亡显著增多，Western blotting结果显示凋亡的特异性分子caspase3表达水平显著升高。上述结果表明，自噬有助于细胞衰老的发生，并且维持衰老细胞的存活;抑制自噬后，细胞衰老的发生显著减弱，凋亡显著增多。 综上所述，我们的研究结果提示以下结论: 1、低剂量化疗药物可激活持续的DNA损伤反应通路进而介导结肠癌细胞衰老的发生。 2、低剂量化疗药物可激活AMPK-TSC2-mTOR通路进而介导结肠癌细胞自噬的发生。 3、自噬可通过调控DNA损伤反应相关蛋白p53、p21的表达进而影响细胞衰老的发生，并且有助于维持衰老细胞的存活;自噬抑制后，细胞衰老的发生显著减弱，凋亡显著增多。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 低剂量化疗诱导的DNA损伤反应在结肠癌细胞衰老中的作用

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第二部分 自噬在低剂量化疗诱导的结肠癌细胞衰老与凋亡中的作用

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

总结

综述 自噬和衰老在肿瘤治疗中的作用

附录

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