Upd1和FMRF酰胺神经肽在果蝇睡眠和免疫调节中的作用

摘要

研究目的： 睡眠是人类不可或缺的生理现象，对人们的健康和生活都有重要的影响。同时，睡眠也是极其复杂的生理过程，虽然经历几十年的研究，其功能和调节机制仍然还不十分清楚。很多学者认为睡眠和免疫系统是相互影响的，一方面免疫基因可以促进睡眠，同时睡眠又受到机体免疫功能和病理状态的影响。过去20年，通过对哺乳动物睡眠和免疫系统关联性的研究表明，这两个系统通过细胞因子错综交织，相互影响，而炎症细胞因子如IL-1β和TNF-α与睡眠增多的现象存在明确的因果关系。但是，目前对于炎症分子调节睡眠的机制以及睡眠在疾病恢复过程中的作用仍然还不清楚。 临床观察发现，创伤、炎症以及感染的初期，病人往往表现出发热、嗜睡、食欲缺乏以及孤僻不合群等症状。大量研究已经证实，在机体的这些急性期反应的表现中，发热是一种保护性反应，可抑制病毒的复制，增强机体的抗感染能力，而急性反应期所观察到的睡眠增加是否也像发热一样是机体的保护性反应呢？ 研究方法和结果： 该研究的第一部分，将阐述细胞因子Upd1通过JAK-STAT信号通路对果蝇睡眠和免疫系统的调节作用。首先，介绍近年来采用果蝇作为经典模式生物研究睡眠免疫行为的优势，接下来通过了解细胞因子和JAK-STAT信号通路在哺乳动物和果蝇中的研究进展引出该研究工作。在该研究中，通过经典的UAS/GAL4定位表达系统调控Upd1在脂肪细胞内的表达以及JAK-STAT信号通路的激活情况，探讨了果蝇基础睡眠、免疫应答诱导的急性睡眠反应，以及机体对细菌感染的应答情况。主要研究方法和结果如下: 1、脂肪细胞内特异表达外周细胞因子Upd1可抑制果蝇的生理性睡眠 利用果蝇经典的UAS/Gal4表达系统，首先探讨了外周细胞因子Upd1过表达后对果蝇基础睡眠的影响。分别将S1106-Gal4、Yolk-Gal4品系处女果蝇和UAS-Upd1雄性果蝇杂交获得脂肪细胞内特异表达Upd1的子代果蝇。通过检测子代果蝇的基础睡眠发现，与对照果蝇相比，两组果蝇果蝇白天睡眠均减少，夜间睡眠没有明显改变。这一结果提示外周细胞因子Upd1可能对果蝇的基础睡眠具有抑制作用。 2、细胞因子Upd1通过中枢JAK-STAT信号通路介导了对生理睡眠的调节 为探讨JAK-STAT信号通路是否参与介导外周细胞因子Upd1对基础睡眠的调节，将含有10XSTAT92E-dGFP报告蛋白的雄性果蝇与基因型为Yolk-Gal4＞UAS-Upd1的处女果蝇杂交，通过平衡子(balancer)的辅助，经过一系列杂交，最终获得基因型分别为:10×STAT-dGFP/+; Yolk/UAS-Upd1和10×STAT-dGFP/+; UAS-Upd1/TM6B子代果蝇。前者果蝇脂肪细胞内特异表达Upd1，同时携带10XSTAT92E-dGFP报告蛋白，后者与前组果蝇含有50％的相似基因，但不表达Upd1，可以作为同胞对照果蝇。通过免疫染色脑内GFP荧光蛋白的表达反映STAT92E的激活情况。结果发现:与对照组相比较，在脂肪细胞内特异表达Upd1的果蝇脑内，GFP蛋白在睡眠调节区域如蘑菇体和脑间质的表达显著增强。免疫组化的结果从分子表达的层面直观的显示:外周脂肪内Upd1过表达后，JAK-STAT信号通路在果蝇脑内睡眠调节区域被激活。 接下来，探讨了果蝇脑内JAK-STAT信号通路被激活后的功能效应。利用Gene-Switch启动子MB-Switch在果蝇大脑睡眠调节区域蘑菇体内特异表达JAK-STAT的受体Domless的失活形式Dom△cyt，阻断JAK-STAT通路，从而使Upd1无法发挥生物学效应。结果显示，阻断JAK-STAT信号通路后，Upd1对果蝇生理性睡眠的抑制作用消失。相反，果蝇白天睡眠增加。结合以上两方面的结果我们推测Upd1对中枢睡眠的可能调节机制:脂肪细胞分泌的细胞因子Upd1通过淋巴循环等通路进入中枢后，激活睡眠调节区域如蘑菇体和脑间质的JAK-STAT信号通路，从而介导了对生理性睡眠的抑制作用。 3、细胞因子Upd1通过中枢JAK-STAT信号通路介导了损伤过程中的急性期睡眠反应 接下来通过给予果蝇注射损伤处理后，研究Upd1对果蝇注射损伤诱导的急性睡眠反应的影响。结果发现，与同胞对照果蝇相比，Upd1过表达的果蝇注射损伤后诱导的急性期睡眠反应减少。反之，特异干扰子果蝇脂肪细胞内Upd1的表达后，与同胞对照果蝇相比，注射损伤诱导的急性睡眠反应增加。而用Dilp2-Gal4雌性果蝇与UAS-Dom△cyt雄性果蝇杂交，获得特异阻断中枢脑间质Dilp2分泌神经元内JAK-STAT通路受体信号转导的子代果蝇。与亲代Gal4和UAS品系果蝇相比，该基因型果蝇由注射损伤诱导的急性睡眠反应增加。同样，在脑间质Dilp2分泌神经元过表达JAK-STAT负性调节蛋白SOCS36E，与亲代果蝇相比，注射损伤诱导的急性睡眠反应也增加。 这一系列结果表明Upd1可以通过JAK-STAT通路调控注射损伤诱导的免疫应激过程中的急性睡眠反应。Upd1过表达会抑制急性睡眠反应，而干扰Upd1的表达或阻断JAK-STAT信号通路，会使急性期睡眠反应增强。 4、外周细胞因子Upd1通过中枢JAK-STAT信号通路介导增强了果蝇对细菌感染的免疫应答 为探讨Upd1对果蝇免疫功能的影响，给予果蝇等量细菌感染后，检测Upd1基因改造的果蝇感染后的睡眠改变以及生存率的变化。结果发现在脂肪细胞内过表达Upd1，激活JAK-STAT通路，果蝇感染后的急性期睡眠减少，但生存率提高。相反，抑制脂肪细胞内Upd1表达后，果蝇感染后急性期睡眠增加，生存率降低。而在中枢脑间质Dilp2分泌神经元内特异表达JAK-STAT信号转导通路的负性调节蛋白SOCS36E和受体Domless的截断失活形式Dom△cyt，特异阻断JAK-STAT通路的信号转导。与亲代Gal4和UAS品系果蝇相比，该基因型果蝇感染后的急性期睡眠增加，生存率降低。 总之，这一系列研究证明了UPD1通过JAK-STAT信号通路不仅调控果蝇的基础睡眠，而且对免疫诱导的急性睡眠反应也有影响。而果蝇睡眠和内在固有免疫系统之间共有的调节通路也提示两者功能上存在关联性。与以往研究JAK-STAT信号通路在免疫应答中的作用不同之处在于，该研究首次发现外周细胞因子Upd1可以通过激活中枢睡眠调节区域的JAK-STAT信号通路，增强机体的免疫功能。 第二部分，该研究深入探讨了FMRF酰胺神经肽在果蝇应激性刺激引起的急性睡眠反应以及机体免疫应答中的相关作用。FMRF酰胺神经肽是无脊椎动物体内含量最丰富的一类神经肽，并且参与大量行为和生理活动的调节。在线虫低氧刺激中的研究发现，FMRF类神经肽参与了应激相关的适应性反应。在该研究中，通过比较FMRF酰胺神经肽受体突变果蝇FRMBO4659与野生W1118果蝇在面对不同应激性刺激的行为差异，研究并探讨了该神经肽在果蝇应激性刺激引起的急性睡眠反应以及与机体免疫应答中的相关作用。主要研究方法和结果如下: 1、与野生W1118果蝇相比，FRMBO4659果蝇由热刺激引起的急性睡眠反应减少 在ZT18，将野生W1118果蝇和FRMBO4659果蝇同时置于37℃环境中热刺激1个小时，然后取出放回25℃孵箱，继续记录果蝇睡眠及生存率的变化。结果发现两组果蝇在热刺激过后，睡眠出现短暂增加。但与野生W1118果蝇相比，FRMBO4659果蝇由热刺激引起的急性睡眠反应减少，两组果蝇生存率并没有统计学差异。 2、与野生W1118果蝇相比，FRMBO4659果蝇在细菌感染后引起的急性睡眠反应减少，生存率降低 在ZT18，分别给两组果蝇注射等量的革兰阴性致病菌Serratia Marsescens，然后监测睡眠行为的改变以及生存率变化。结果显示，细菌感染后，在ZT0-4时间段，两组果蝇睡眠增加尤为显著。与野生W1118果蝇相比，FRMBO4659果蝇在细菌感染后引起的急性睡眠反应减少，同时，生存率也显著降低。 3、与野生W1118果蝇相比，FRMBO4659果蝇对细菌的清除能力降低 为检测果蝇对体内细菌的清除能力，分别在感染即刻收集8-10只果蝇，匀浆并涂板统计菌落形成单位。同样的方法，在感染24h后分别收集两组存活的果蝇匀浆涂板。统计发现，在感染即刻涂板后，两组果蝇的菌落形成单位没有统计学差异，说明两组果蝇被接种细菌量没有差异。感染24小时后，FRMBO4659果蝇的菌落形成单位远远高于野生W1118果蝇，说明FRMBO4659果蝇对细菌清除能力降低。 该研究主要发现和总结： 该研究在睡眠模式生物果蝇中探讨了细胞因子Upd1和FMRF酰胺神经肽对于睡眠和免疫过程的调节作用。研究发现外周细胞因子Upd1可以通过中枢睡眠相关区域的JAK-STAT信号通路抑制果蝇的生理性睡眠和免疫应答相关的急性睡眠反应，同时增强果蝇的免疫应答。同样，FMRF酰胺神经肽也参与介导应激性刺激诱导的急性期睡眠反应和免疫应答。研究还发现急性期睡眠的增加量与细菌感染后果蝇的预后密切相关。总之，该研究通过探讨细胞因子和神经肽对睡眠和免疫功能的调节揭示了睡眠和免疫系统的关联性，并且提示急性期睡眠反应可能对机体的健康恢复有益。该研究为研究细胞因子和神经肽在睡眠调节中的作用开辟了一条新的途径，有望为进一步探讨睡眠和免疫系统相互作用的机制提供线索。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词表

第一章 Upd1通过JAK-STAT信号通路调节果蝇的睡眠和免疫

一、引言

(一)果蝇作为睡眠免疫研究模型的优势

(二)细胞因子与睡眠和免疫

(三)JAK-STAT信号通路

(四)本研究的引出

二、实验方法及实验过程

(一)实验材料

(二)试验方法

三、实验结果

(一)过表达外周细胞因子Upd1抑制果蝇的生理性睡眠

(二)Upd1通过JAK-STAT信号通路调节果蝇的生理性睡眠

(三)Upd1通过JAK-STAT信号通路调节损伤诱导的急性睡眠反应

(四)Upd1通过JAK-STAT信号通路调节果蝇的免疫应答

四、讨论

参考文献

第二章 FMRF酰胺神经肽调节果蝇睡眠和免疫调节

一、前言

二、实验方法及实验过程

(一)实验材料

(二)试验方法

三、实验结果

(一)FMRF酰胺神经肽受体在果蝇脑内广泛表达

(二)FRMBO4659果蝇的基础睡眠量在白天增加，夜间减少

(三)FRMBO4659果蝇由热激处理诱导的急性睡眠反应减少

(四)FRMBO4659果蝇由感染诱导的急性睡眠反应减少，生存率降低

(五)FRMBO4659果蝇细菌清除能力亦降低

四、讨论

参考文献

全文小结

意义

文献综述 睡眠与睡眠障碍的遗传学研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢