旋覆花倍半萜内酯化合物IJ--5的类风湿关节炎治疗效应及作用机制研究

摘要

类风湿关节炎（RA）是一种以损害关节滑膜、软骨和骨骼为特征的慢性炎症性疾病。类风湿关节炎的发病机制尚不完全清楚，但免疫细胞及转录调控因子的异常激活是其发生和发展的重要因素。近年来，天然植物中发现了许多具有抗炎抗氧化活性的化合物，可应用于类风湿关节炎等炎症性疾病的治疗。课题组前期的研究就发现旋覆花中的多种倍半萜内酯化合物可以抑制转录因子NF-κB的激活，进而发挥抗炎作用。但目前国内外尚无此类化合物治疗类风湿关节炎的临床前研究报道，同时其作用机制研究尚不深入，作用位点也不清楚。鉴于此，本课题选择这类化合物中抗炎活性较好的IJ-5进行深入研究，分别在类风湿关节炎动物模型和细胞模型上系统的考察了药物的疗效，并从分子水平上阐明了药物作用的机制，确定了药物作用的靶点，为其临床应用奠定了坚实的基础。 研究方法: 首先建立了鸡胶原诱导的小鼠类风湿关节炎模型(CIA)，在整体动物水平上考察IJ-5对RA的疗效。接着通过实时定量PCR和ELISA等方法，在体外RA病人的原代滑膜细胞上进一步考察了IJ-5对TNF-α诱导的多种炎症因子表达的影响。在此基础上，采用荧光素酶双报告基因法考察了IJ-5对NF-κB信号通路的作用，并进一步采用免疫印迹杂交(IB)的方法考察IJ-5对NF-κB以及相关信号通路蛋白表达和活化的影响。并分别运用Millipore的KinaseProfiler，Invitrogen的Z'-LYTE(R)和DiscoveRx的KINOMEscanTM等激酶活性筛选平台，考察了IJ-5对相关信号通路中激酶活性的影响。为了进一步探明IJ-5的作用机制，在293T细胞上采用免疫共沉淀(IP)的方法考察IJ-5对RIP1和NEMO泛素化的影响。接着构建了体外泛素化酶反应系统，考察了IJ-5对泛素链形成及Ub与相关E2酶结合的影响。最终，通过pull-down实验验证了IJ-5与E2酶UbcH5c的结合作用，并结合LC-OrbitrapCIDMS/MS技术探明了IJ-5与UbcH5c的结合位点。 研究结果: 1、在体内考察了IJ-5对于CIA小鼠的治疗作用。第21天二次免疫后腹腔注射IJ-5(2-10mg/kg/day)进行治疗，和模型组相比IJ-5可剂量依赖性的减轻CIA小鼠关节炎病情。放射学和免疫组化染色结果显示IJ-5可以显著抑制关节组织中炎症细胞的浸润。提取并检测关节组织中的mRNA后发现IJ-5可剂量依赖性的抑制TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1，MMP3和MMP13等多种促炎因子的表达。同时，IJ-5还可降低血清中多种炎症因子如TNF-α，IL-1β和IL-6的表达水平。接着在体外考察了IJ-5对RA病人原代滑膜细胞中多种炎症因子表达的影响。实时定量PCR实验发现IJ-5在2.5-10μm的剂量下可显著降低TNF-α诱导的IL-6，MCP1，IL-8，GRO-α,MIP-1α，RANTES,MMP3和MMP13等多种炎症因子的表达。同时，滑膜细胞上清液中IL-6，IL-8，MCP1和MMP3等炎症因子的分泌也受到明显的抑制。体内外结果均表明IJ-5是通过下调多种炎症因子的表达来发挥治疗RA的作用。 2、由于炎症因子的表达主要是由NF-κB和MAPKs等信号通路来调控的，因此我们首先考察了IJ-5对这两条信号通路的影响。结果显示在2.5-10μm的剂量下IJ-5可以抑制pNF-kB-luc-293T细胞中TNF-α诱导的NF-κB报告基因的表达。在RA病人滑膜细胞中，IB实验发现IJ-5对TNF-α和IL-1β诱导的MAPK通路中p38、ERK和JNK等蛋白的磷酸化均无显著的抑制作用，但可以选择性的阻断TNF-α诱导的IKKβ和IκBα的磷酸化，最终抑制NF-κB通路的激活。以上结果提示IJ-5是通过抑制TNF-α诱导IKKβ及NF-κB的激活来发挥抗炎作用的。 3、鉴于IKKβ上游的激酶可诱导其发生磷酸化激活，此外IKKβ本身也可直接发生泛素化诱导的反式自磷酸化激活，为探讨IJ-5抑制NF-κB通路激活的作用机制，我们进一步分析了IJ-5对IKKβ活化相关激酶的影响。KinaseProfiler和Z'-LYTE(R)平台的激酶活性筛选结果表明在30μm浓度下，IJ-5对IKKβ本身及其上游磷酸化激酶的活性并无抑制作用，这些激酶包括:IKKα、IKKε、TAK1、MAP3K14、MAP3K3、MAP3K8、PI3K、PKBα、PKBβ、PKCθ、PKCζ、PKCε和TBK1等。此外，KINOMEscanTM平台的检测结果表明IJ-5与这些蛋白也无显著的结合作。以上结果提示IJ-5并不是通过抑制IKKβ和其上游激酶的活性来抑制NF-κB的激活。 4、由于蛋白的泛素化也参与TNF-α诱导的IKKβ的磷酸化过程，因此我们推测IJ-5很可能是通过抑制泛素化来抑制IKKβ的自磷酸化激活。研究发现在293T细胞中IJ-5在2.5-10μM的剂量下可剂量依赖性的抑制TNF-α诱导的RIP1和NEMO的泛素化，提示IJ-5可能作用于一个或多个泛素化过程中的因子发挥作用。为了进一步确定IJ-5的直接作用靶点，我们构建了包含泛素E3酶c-IAP1或HIOP/RNF3(LUBAC)，泛素E2酶UbcH5c、E2-25K或UbcH7以及泛素E1酶的细胞外泛素链反应系统。研究发现IJ-5不仅抑制c-IAP1和UbcH5c催化的聚泛素链的形成，还能抑制HIOP/RNF3和UbcH5c催化的直链泛素链的形成。但将系统中的UbcH5c换成其他E2酶如UbcH7和E2-25k时，IJ-5则不能抑制聚泛素的形成，提示UbcH5c很可能是IJ-5的作用靶点。 5、为进一步阐明IJ-5抑制E2酶的作用机制，我们考察了IJ-5对Ub和UbcH5c复合物形成的影响，结果表明IJ-5只抑制Ub与UbcH5家族蛋白如UbcH5a、UbcH5b和UbcH5c的结合而对Ub与其他E2酶如UbcH7和E2-25k的结合则无抑制作用，说明IJ-5是UbcH5家族蛋白酶的选择性抑制剂。为了进一步检测IJ-5是否直接与UbcH5c结合来发挥抑制作用，我们采用Pull-down的方法将滑膜细胞裂解液或重组UbcH5c蛋白与结合或未结合IJ-5的琼脂糖磁珠共孵育，结果显示只有结合了IJ-5的磁珠可以将UbcH5c从细胞裂解液或重组蛋白溶液中拉出来，提示IJ-5是靶向作用于UbcH5c来抑制其活性的。 6、IJ-5是一种倍半萜内酯类化合物，这类化合物中的α，β不饱和羰基可以与蛋白酶中的半胱氨酸发生Michael共价加成反应。鉴于IJ-5可以抑制Ub与UbcH5c活性半v胱氨酸残基Cys85的结合，我们推测IJ-5很可能是通过对Cys85进行共价修饰来抑制UbcH5c的活性。为了验证这一假设，我们将UbcH5c与IJ-5共孵育后进行酶解，并运用LC-OrbitrapCID质谱分析酶解肽段修饰情况，结果发现与不加IJ-5共孵育的酶解肽段相比，m/z为1145.62的肽段发生了J-5共价修饰。对此多肽进行二级质谱序列分析后发现IJ-5和其中的Cys85发生共价结合。 7、以上结果提示IJ-5中α亚甲基上碳原子与UbcH5c的Cys85上硫原子可发生共价结合，为进一步探讨IJ-5与UbcH5c的相互作用模式，我们运用Maestro软件(Schr(o)dingerInc，version9.0)进行计算机虚拟对接，依据自由能最低法则和人工分析确定了最佳对接方式。在这种结合方式下IJ-5可以很好的进入Cys85周围的活性口袋，α亚甲基上碳原子与UbcH5c的Cys85上硫原子发生共价结合，同时，IJ-5结构中的羟基和羰基还能和UbcH5c结构中的Gln92和Asn114发生氢键作用。 结论: 本研究首次发现旋覆花中的倍半萜内酯化合物IJ-5可以直接与泛素结合酶UbcH5c结合并抑制其活性，最终阻断TNF-α诱导的IKK和NF-κB激活过程。我们的研究进一步证实IJ-5可选择性共价修饰UbcH5c活性中心的半胱氨酸残基Cys85并抑制其活性。此外，IJ-5不仅能够在体外抑制内皮细胞和滑膜细胞中TNF-α诱导的多种炎症因子的表达，还能在体内对胶原诱导的RA发挥治疗作用。本研究的意义在于发现了一种新型先导化合物IJ-5可用于炎症性疾病的治疗，而其作用靶点UbcH5很可能成为临床治疗RA的新方向。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、类风湿关节炎及药物治疗简介

二、NF-κB信号通路及其抑制剂在治疗RA方面的应用

三、IKK复合物的泛素化激活TNF-α介导的NF-κB通路

四、中药旋覆花中倍半萜内酯在治疗RA方面的应用前景

第一章 IJ-5体内药效学研究

一、引言

二、实验材料

(一)实验动物

(二)药品与试剂

(三)实验仪器

三、实验方法

(一)溶液配制

(二)CIA小鼠模型建立与关节炎指数测定

(三)取材

(四)microCT成像和HE染色分析

(五)血清中胶原抗体测定

(六)血清中炎症因子测定

(七)Real time-PCR法检测关节组织中相关炎症因子的mRNA

(八)统计分析方法

四、实验结果

(一)IJ-5对CIA模型小鼠的治疗作用

(二)IJ-5对CIA关节炎模型小鼠的关节的保护作用

(三)IJ-5对CIA模型小鼠血清中的抗体表达的影响

(四)IJ-5对CIA模型小鼠血清中的主要炎症因子水平的影响

五、小结与讨论

第二章 IJ-5的体外药效学研究

一、引言

二、实验材料

(一)原代细胞及细胞株

(二)药品和试剂

(三)主要仪器

三、实验方法

(一)溶液配制

(二)RA原代滑膜细胞活力检测(MTT法)

(三)RA滑膜细胞中炎症因子mRNA检测

(四)细胞上清中炎症因子检测

(五)双荧光素酶报告基因核转录因子活性检测

(六)Western Blot方法检测滑膜细胞内的NF-κB信号通路因子

四、统计分析方法

五、实验结果

(一)IJ-5对TNF-α诱导的细胞活力的影响

(二)IJ-5对滑膜细胞中炎症因子mRNA表达的影响

(三)IJ-5对滑膜细胞上清中部分炎症因子水平的影响

(五)IJ-5对TNF-α诱导的NF-κB激活的影响

(六)IJ-5对MAPKs信号通路的影响

(七)IJ-5对NF-κB信号通路的影响

六、小结与讨论

第三章 IJ-5的作用靶点研究

一、引言

二、实验材料

(一)细胞株

(二)药品和试剂

(三)主要仪器

三、实验方法

(一)主要试剂配制

(二)Hsp90活性测定

(三)IKK及其上游激酶的活性检测

(四)293T细胞内RIP及NEMO的泛素化水平检测

(五)体外泛素酶活测定

(六)Pull-down实验

(七)Bicore实验

(八)LC-MS确定IJ-5与UbcH5c的共价结合位点

(九)计算机拟合IJ-5与UbcH5c的结合方式

四、结果

(一)IJ-5对HSP90酶活的影响

(二)IJ-5对IKKβ及其上游激酶酶活的影响

(三)IJ-5对泛素化的影响

(四)IJ-5对体外泛素链形成的影响

(五)IJ-5对不同E2介导的泛素链形成的影响

(六)IJ-5对E2-Ub聚合物形成的影响

(七)Pull-Down法验证IJ-5与UbcH5c的结合作用

(八)Biacore法检测IJ-5与Ubc5的相互作用

(九)LC-MS法寻找IJ-5与UbcH5c的结合位点

(九)计算机拟合IJ-5与UbcH5c的结合方式

五、小结

总结

参考文献

致谢