肝细胞癌外周血淋巴细胞中参与关键HBV变异选择的关键分子预测及网络构建

摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)居全球最常见肿瘤的第6位及肿瘤相关死亡的第3大常见原因。超过50％的HCC病例发生在我国，HCC的发生受环境因素、病毒因素和机体遗传因素等综合影响。HCC分子机制中的复杂过程表明多种基因参与了HCC的发生发展。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染是我国HCC的主要危险因素，HBV慢性感染导致慢性炎症，某些细胞因子高表达，在转录水平活化某些酶类表达，可显著增加病毒和人基因组的不稳定性，病毒变异经过失衡的免疫选择，筛选出免疫逃逸变异型HBV，后者参与炎症网络调控并具有协同促癌功能。诸如与HCC发生显著相关的HBV变异C1653T、T1753V、和A1762T/G1764A，在慢性HBV感染到HCC发生过程中逐渐累加，这些变异可预测HCC发生。A1762T/G1764A变异、preS缺失(＜100bp)和病毒载量与HCC生存时间短密切相关，其中A1762T/G1764A变异和病毒载量是HBV相关HCC的独立危险因素。由此可见HBV变异是HCC的重要危险因素。 近年来，基因芯片与生物信息分析工具广泛应用于筛选HCC中差异表达基因和预测HCC诊断及预后分子标志。另外，MicroRNAs(miRNAs)作为mRNA表达转录后调节因子参与了多种细胞进程。由于单个miRNA可以调控多个靶mRNAs并且单个mRNA可以对应多个miRNAs，可见miRNAs与mRNAs存在复杂的网络联系，而目前研究多是关注HCC组织与癌旁组织中某些信号通路上的单个或多个差异基因，或者仅仅几个差异表达miRNAs及它们的靶mRNA而忽略了miRNA-mRNA的网络联系。本研究以HBV变异为切入点，研究HCC患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes，PBL)中的炎症因子表达谱及miRNAs与其靶基因/信号通路间的网络联系，对于明确HBV变异的免疫选择机制及预测HCC诊断及预后分子标志具有重要作用。 目的:以HBV变异为切入点，研究HCC与非HCC HBV感染者PBL中差异表达基因和差异表达miRNAs，发现乙肝恶性转化过程中HBV变异选择相关的免疫信号网络变化规律及关键免疫亚网络标志。 方法:本研究采用巢式PCR法对HCC患者和非HCC HBV感染者EnhII/BCP/PC和preS区进行扩增，获得HBV变异序列，选择出符合变异要求的26例HCC、15例非HCC HBV感染者;抽提外周血中PBL，裂解细胞得到总RNA;分别应用Affymetrix GeneChip PrimeView Human Gene Expression Array及Affymetrix GeneChip miRNA3.0 Array对上述样本中PBL进行mRNA表达谱及miRNA芯片检测。软件工具包括SPSS16.0软件;R软件;GSEA(Gene setenrichment analysis)软件;GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes)数据库;基因名称转换工具(Clone/Gene ID Converter);生物学网络可视化分析工具(Cytoscape); STRING; netbox软件;基于PubMed文献关系分析工具Chilibot;在线Molecule annotation system(MAS)工具等，利用上述软件工具对芯片杂交数据进行分析、挖掘和结果展示。 结果: 1.差异表达基因及所在通路 根据芯片基因变化倍数≥2的标准，本研究共有168个基因被确定为差异表达基因，包括114个上调基因和54个下调基因，其中ITGB1、ITGA2B、ITGB1、THBS1、SOS1、TLN1、CD79A等曾报道与HCC发生或免疫相关。经过GO基因功能注释及KEGG通路富集分析发现，差异基因在9条通路上具有显著富集性，包括局部黏附、原发性免疫缺陷、致心律失常性右室心肌病、p53信号通路、MAPK信号通路、缝隙连接、系统性红斑狼疮、肌动蛋白细胞骨架调节、移植物抗宿主病，其中局部黏附、p53信号通路、MAPK信号通路、移植物抗宿主病等信号通路已报道和肿瘤发生发展相关。 2.差异表达基因的文献注释 利用在线文献注释检索工具Chilibot对168个差异基因进行检索发现有83个基因与关键词(“cancer”)发生至少一次共存关系，其中有68个上调基因，15个下调基因。67个基因与关键词(“hepatocellular carcinoma”)发生至少一次共存关系，其中有53个上调基因，14个下调基因。48个基因与关键词(“immune”)发生至少一次共存关系，其中有32个上调基因，16个下调基因。63个基因同时与“hepatocellular carcinoma”及“immune”发生至少一次共存关系，其中上调基因49个、下调基因14个;进一步排除仅与文献摘要共存关系的基因，共有30个基因同时与“hepatocellular carcinoma”及“immune”共存，其中24个为上调基因，6个为下调基因，这些基因可能是HCC发生发展中与HBV变异免疫选择相关的基因。 3.差异表达基因相互作用网络图 按照HCC vs.non-HCC，根据≥1.7fold change(P＜0.05)的标准，获得62个altered gene和49个linker gene，并作相互作用网络分析，网络图显示PIK3R1、SHC1、PTK2、GRB2、ITGB1、ITGA2B、ITGB3、COL1A1、PTPN1、COL1A2、FN1、PIK3CA、AKT1、CSK、ITGA6、RASA1、ITGB2、DOK1、TLN1、THBS1、CD79A、SOS1与其他基因之间相互作用数≥10，可作为此相互作用网络的关键节点分子。 4.差异表达基因功能注释分析 (1)差异基因参与的生物学过程主要集中在对刺激反应的正向调节、免疫系统调节、运动、创伤反应、免疫反应，与免疫系统反应联系较为紧密。 (2)差异基因主要的分子功能为蛋白二聚化反应、酶类结合、受体结合、蛋白异二聚化反应、同种蛋白结合、激酶活性，与蛋白结合、二聚化或异二聚化有联系。 (3)差异基因相关的表型缺陷主要体现在血液及造血组织异常、肿瘤、白细胞异常、淋巴细胞异常、血液肿瘤、免疫系统生理功能异常、B细胞异常、复发性感染，主要与循环及免疫系统功能异常相关。 (4)差异基因主要与慢性髓性白血病骨髓中分离的CD34+细胞中上调基因、人干细胞基因、人胚胎干细胞基因、启动子结合在FOXP3的杂交瘤细胞基因、乳腺细胞基因、肝细胞基因发生共表达。 5.差异表达miRNAs及靶基因功能注释 根据芯片基因变化倍数≥2的标准，本研究共确定了差异表达miRNAs共103个，其中上调的miRNAs有49个，下调的miRNAs有54个。靶基因功能主要集中于DNA依赖的转录调节、信号转导、多细胞生物发育、DNA依赖的转录、跨膜运输等生物学过程;通过KEGG富集分析发现靶基因功能注释主要集中于肿瘤通路、MAPK信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、胞吞作用、局部黏附。miR-548a-3p, miR-181c-5p, miR-181d, miR-145-5p, miR-26b-5p, miR-195-5p,miR-182-5p，miR-421，miR-382-5p与其他miRNA之间相互作用数≥15，可作为关键miRNA。 6.mRNA-miRNA相互作用网络 按照Fold-Change≥2.0 miRNA预测的靶基因与差异表达基因作交集，获得了57个差异表达基因与14个差异表达miRNA相互作用网络图;Netbox及MAS分析得到的关键节点分子与miRNA的靶基因作交集，绘制39个hub基因与14个差异表达miRNA相互作用网络图。 结论:差异表达基因中THBS1，CD79A，TLN1，SOS1，ITGB1，ITGA2B，ITGB3及差异表达miRNA中miR-548a-3p，miR-181c-5p，miR-181d，miR-145-5p，miR-26b-5p，miR-195-5p，miR-182-5p，miR-421，miR-382-5p可能与HCC发生发展或免疫相关，且参与HCC特异性HBV变异的免疫选择，尚待进一步验证。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

第二章 材料与方法

一、实验材料

二、研究对象

三、研究方案

第三章 结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 胞苷脱氨酶促进乙型肝炎病毒进化并将炎症和肝细胞癌相联系

硕士期间发表的论文

致谢