基于药物代谢动力学和网络药理学的中药复方四逆汤配伍规律研究

摘要

中药复方是中医用药的主要形式，是基于辩证观点，按照君臣佐使的组方原则选择中药饮片定量配伍而成。当前，中药复方通过多成分、多靶点、多途径协同拮抗的整体作用发挥综合药理药效的组方理论已成为共识，但对于中药复方配伍机制的本质认识和微观阐述仍然比较模糊。对于口服中药复方来说，其药理作用的发挥是吸收入血的药效成分通过“多成分-多靶标”相互作用、协同制衡的综合结果，因此，药效成分的体内处置过程和“成分-靶标”的关联分析是中药复方配伍规律解析的关键。 四逆汤是《伤寒论》中的经典名方，具有回阳救逆之功效，现代常用于心肌梗死和心力衰竭等急慢性疾病的临床治疗，由附子、干姜、甘草组成，是“回阳救逆第一品药”。本课题基于药物代谢动力学和网络药理学对中药复方四逆汤的配伍规律进行研究，主要分为以下几个部分： 第一部分:基于药物代谢动力学的中药复方四逆汤配伍规律的研究 附子中主要有效成分为二萜类生物碱，包括双酯型、单酯型和胺醇型乌头碱，其中双酯型乌头碱的毒性最大，单酯型乌头碱毒性较小，活性较强，而醇胺型乌头碱毒性和活性最小。炮制后的附子毒性显著降低，而主要药理作用未改变，仍具有显著的抗心力衰竭、抗休克及镇痛作用。本研究通过实验证明，炮制和煎煮附子的作用机理在于，在加热过程中，附子双酯型生物碱成分转化为了单酯型和醇胺型生物碱，从而起到减毒增效的作用。通过灌胃给药附子三个单酯型生物碱，测定三个单酯型生物碱的药代动力学参数，结果显示3个单酯型生物碱成分能够迅速被吸收到体内但难以被代谢或排泄，体外Caco-2细胞吸收实验证明，这些生物碱成分的吸收受到p-糖蛋白等转运蛋白的抑制。干姜、甘草配伍附子灌胃给药后，附子中生物碱类成分药代动力学参数发生明显变化，表明四逆汤中配伍药材影响了附子中生物碱成分的体内处置过程。进一步通过灌胃给药大鼠甘草苷、6-姜酚和乌头碱单体，研究甘草苷和6-姜酚对乌头碱药代动力学的影响，体外Caco-2细胞吸收实验表明，乌头碱受到P-糖蛋白的抑制，但甘草苷和6-姜酚，特别是6-姜酚能够抑制P-糖蛋白的作用，从而极大地促进乌头碱通过肠壁的吸收。这从一定程度上解释了“附子无干姜不热”的中医理论，明确了四逆汤主要生物碱成分的ADME特征，从活性成分吸收代谢特征方面揭示了四逆汤组方减毒增效的科学意义。 第二部分:基于网络药理学的中药复方四逆汤治疗心血管疾病的配伍规律研究 本部分，基于网络药理学，首先构建四逆汤中已报告过的347个化学成分的数据库，根据四逆汤提取物及入血成分分析结果，优选其中的38个化学成分用于后期的成分靶点筛选。然后整合构建心血管靶点数据库，通过在线“成分与靶点虚拟对接”的方式，从四逆汤君药附子中筛选出25个生物碱成分，从甘草中优选出12个黄酮类成分，干姜中选择含量最高活性最强的6-姜酚成分，进行在线靶点对接和筛选，结合文献报道和成分靶点虚拟对接结果，发现四逆汤中38个化学成分与34个心血管疾病的靶点有效结合，这些作用靶点主要集中在ANS自主神经系统、RAAS肾素血管紧张素系统、凝血系统、离子通道、HMGCR羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶和GCR糖皮质激素受体。ANS自主神经系统是起强心作用的主要靶点，附子中生物碱成分、干姜中6姜酚和甘草中甘草苷等黄酮类成分都部分的作用于ANS自主神经系统的一些靶点，因此可解释为复方中三味中药可起到协同强心作用，甘草中黄酮类成分通过作用于GCR糖皮质激素类受体和钠、钾、钙离子通道起到缓解附子生物碱引起的心率失常，从而起到减毒的作用，干姜通过作用于凝血系统中的凝血因子从而起到增强强心作用，最终综合这些成分靶点信息，通过构建“疾病-靶点-成分”相关的复方中药四逆汤成分靶点作用网络图，揭示中药复方四逆汤“君臣佐使”的配伍规律和协同拮抗的配伍机制，这些发现有助于推动中药复方四逆汤的临床推广应用和作用机理的阐明。 第三部分:四逆汤药理作用的评价与相关作用靶点的验证 为了验证通过虚拟分子对接方法预测的四逆汤“成分-靶点”网络药理作用结果，选择了四逆汤组方药材中的3个代表性成分乌头碱、6-姜酚和甘草苷用于验证预测结果。首先，建立由冠状动脉左前降支结扎诱导的慢性心力衰竭大鼠模型，对四逆汤药材配伍、组分配伍和成分配伍后研究其对大鼠心衰的治疗作用，结果显示3个给药组都能对大鼠慢性心力衰竭具有一定的治疗作用，且治疗效果相当。甘草苷、6-姜酚和乌头碱联合给药后，发现甘草苷能减轻由乌头碱引起的心律不齐，6-姜酚能提高乌头碱对正常大鼠的血流动力参数，证明甘草苷和6-姜酚在成分配伍中分别具有减毒和增效作用；通过分子虚拟对接，筛选出与乌头碱有较高结合的靶点蛋白β1肾上腺素受体，结合动物和细胞实验证明，β肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔能够抑制乌头碱对正常大鼠的强心作用，并抑制乌头碱增强正常心肌细胞正性肌力的作用，证明乌头碱可通过激动β1肾上腺素受体发挥对大鼠的强心作用。体外表面等离子体共振实验证明HMGCR能与6-姜酚和乌头碱结合，ACE能与乌头碱、6-姜酚和甘草苷结合。通过作用于羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶靶点，可以降低低密度脂蛋白和胆固醇水平，从而降低心脏病和中风发作的风险，作用于血管紧张素转化酶这个靶点，可以实现调节血压并提高对心力衰竭和冠状动脉疾病控制的目的，研究表明HMGCR抑制剂和ACE抑制剂联合使用可以很好地治疗心血管疾病在临床上常见的并发症，所以6-姜酚和甘草苷在治疗心血管疾病中起协同作用，提示乌头碱是配伍中的主要成分，甘草苷和6-姜酚为辅助成分，6-姜酚可以提高乌头碱的强心作用，甘草苷可以缓解乌头碱引起的心律失常。综上，中药复方四逆汤三味组方药材的代表性成分乌头碱、6-姜酚和甘草苷可通过作用于相同或不同的靶点而发挥协同拮抗作用。

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