基于代谢组学和网络药理学的当归四逆汤干预类风湿性关节炎疾病的机制研究

摘要

目的:
　　1.采用代谢组学研究技术对类风湿性关节炎大鼠进行尿液核磁共振分析，通过筛选潜在生物标志物并对比与治疗组之间水平的变化，评价当归四逆汤对类风湿性关节炎的干预作用。
　　2.采用网络药理学的研究方法，构建中药复方-活性成分-作用靶点-疾病网络图，从而找到当归四逆汤干预类风湿性关节炎可能的潜在作用靶点，进一步阐释当归四逆汤干预类风湿性关节炎的作用机制。
　　3.对代谢组学和网络药理学的研究结果进行整合，旨在从代谢层面和基于计算机模拟技术的基因层面阐述当归四逆汤干预类风湿性关节炎的分子机制，并对结果进行初步验证。
　　方法:
　　1.建立牛二型天然胶原诱导的关节炎大鼠疾病模型，将雌性SD大鼠32只，随机分为空白对照组(n=8)和造模组(n=24)。适应一周后，给予模型组尾部注射400μl等体积混合的牛二型天然胶原混合弗氏不完全佐剂溶液，制备胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎大鼠模型(CIA)，空白组注射生理盐水。7天后模型组再次注射100μl等体积混合的牛二型天然胶原弗氏不完全佐剂溶液，空白组注射等体积的生理盐水。于造模第20天开始灌胃给药，分成空白组、模型组、阳性对照组和当归四逆汤给药治疗组，给药3周。
　　2.通过探讨体重、足跖厚度变化以及关节组织病理学检查结果评价造模结果，讨论当归四逆汤的干预作用。
　　3.对疾病模型进行更深入的分析，采用基于核磁共振的代谢组学分析技术，结合多元统计分析，在代谢层面寻找模型组和空白组尿液代谢物质差异，并分析其差异物质与类风湿性关节炎可能存在的关系，旨在发现与治疗类风湿性关节炎疾病相关的潜在生物标志物;进一步表征当归四逆汤对模型大鼠尿液内源性代谢产物的变化规律，发现当归四逆汤干预类风湿性关节炎的代谢通路,阐述当归四逆汤干预类风湿性关节炎的分子机制。
　　4.对当归四逆汤七味药材:当归、桂枝、细辛、大枣、白芍、通草和甘草进行化学成分统计，并筛选其有效成分，根据有效成分预测其可能作用的靶点。
　　5.通过数据库查询类风湿性关节炎疾病的相关基因靶点。
　　6.使用网络可视化软件Cytoscape3.2.1软件建立当归四逆汤-化学成分-靶点-疾病的关系网络，找到二者相互关联的基因靶点。
　　7.对相关基因进行富集分析，确定当归四逆汤主要干预的信号通路，初步预测当归四逆汤对类风湿性关节炎的干预机制。
　　8.对代谢组学和网络药理学的研究结果进行整合，讨论当归四逆汤对类风湿性关节炎的具体干预机制。
　　9.检测血清生化指标肿瘤坏死因子（TNF-α)变化，对研究结果进行初步验证。
　　结果:
　　1.胶原诱导的关节炎大鼠尿液中找到7个潜在的生物标志物，其中丙酮、琥珀酸和丙酮酸的水平升高，牛磺酸、尿素、甜菜碱和马尿酸的水平降低。判断其主要扰动了氨基酸和肠道微生物代谢、能量代谢和脂质代谢。
　　2.当归四逆汤对胶原诱导的关节炎大鼠尿液中丙酮、琥珀酸和丙酮酸有下调作用，对牛磺酸、尿素、甜菜碱和马尿酸有上调作用。主要通过回调牛磺酸和亚牛磺酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，肠道微生物代谢，丙酮酸代谢，TCA循环，糖酵解和糖异生以及脂质代谢发挥作用。本论文的研究结果为后期类风湿性关节炎的治疗和深入研究中药对疾病的作用机制提供新的思路。
　　3.经过网络药理学研究，在当归四逆汤中共统计有效成分138个。与类风湿性关节炎相关的疾病基因共185个。用Cytoscape软件进行当归四逆汤-化学成分-靶点-疾病网络构建，共发现19个相关基因靶点。
　　4.对基因靶点进行富集分析，共富集到13条信号通路，其中肿瘤坏死因子信号通路富集得分最高，推测其可能为当归四逆汤干预类风湿性关节炎的主要信号通路。
　　5.整合代谢组学和网络药理学的研究结果发现，当归四逆汤主要通过调控氨基酸代谢、能量代谢和脂质代谢紊乱发挥作用。其中，当归四逆汤可调控肿瘤坏死因子信号通路紊乱使牛磺酸和亚牛磺酸代谢通路中的GAD1、GGT1、GAD2基因的表达趋于正常。
　　结论:
　　1.当归四逆汤能改善胶原诱导的关节炎大鼠血清生化指标、体重和足跖病变以及关节病理学改变，对类风湿性关节炎疾病具有积极的干预作用。
　　2.胶原诱导的关节炎大鼠模型可引起大鼠尿液代谢轮廓显著变化，明显扰动氨基酸和肠道微生物代谢、能量代谢和脂质代谢，当归四逆汤对这些受扰动的代谢通路具有回调作用。
　　3.经过网络药理学研究发现当归四逆汤可通过干预类风湿性关节炎疾病中的肿瘤坏死因子信号通路发挥作用。

目录

声明

个人简历

中英文略词表

摘要

前言

参考文献

第一章 基于代谢组学的当归四逆汤对胶原诱导的关节炎大鼠干预作用机制的研究

1．实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验药品

1．3 实验试剂

1．4 实验仪器

2．实验方法

2．1 造模及给药方法

2．2 标本留取

2．3 样本前处理

2．4 核磁共振测定条件

2．5 数据处理和多元统计分析

2．6 潜在生物标志物的发现

2．7 潜在生物标志物的识别和代谢网络的构建

2．8 可视化网络构建

3．结果

3．1 大鼠的一般情况

3．2 当归四逆汤对大鼠关节组织病理形态的影响

3．3 代谢物的归属

3．4 代谢轮廓的分析以及潜在生物标志物的鉴定

3．5 当归四逆汤对胶原诱导关节炎大鼠尿液代谢轮廓的影响

3．6 代谢通路分析

3．7 可视化网络构建结果

4．讨论

4．1 氨基酸代谢和肠道微生物代谢

4．2 糖酵解／糖异生和TCA循环

4．3 脂质代谢

参考文献

本章小结

第二章 基于网络药理学的当归四逆汤对类风湿性关节炎作用靶点的研究

1．实验材料

2．方法与结果

2．1 活性成分的筛选

2．2 活性成分作用靶点和类风湿性关节炎疾病靶点的查找

2．3 当归四逆汤干预类风湿性关节炎网络图的构建

2．4 通路的富集分析

2．5 网络药理学和代谢组学结果整合分析

2．6 相关靶点的验证

3．结果

3．1 药材-化学成分统计结果

3．2 疾病-靶点统计

3．3 当归四逆汤-化学物质靶点的网络分析

3．4 疾病靶点网络的构建

3．5 当归四逆汤-成分-靶点-疾病网络图的构建

3．6 通路富集分析结果

3．7 通路富集分析可视化

3．8 网络药理学和代谢组学结果整合分析

3．9 相关靶点验证

4．讨论

参考文献

本章小结

全文结论

综述 当归四逆汤的化学成分分类、药理作用和临床应用研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文