“痰瘀同治”方药调控肥大细胞功能改善动脉粥样硬化斑块的机制研究

摘要

研究背景:动脉粥样硬化(AS)导致的心脑血管疾病是当今人类死亡的首位原因，其重要的特征之一就是病灶处各类炎症、免疫细胞的聚集浸润。肥大细胞作为机体分泌最活跃的细胞之一，主要通过脱颗粒、释放颗粒内容物产生多种活性介质等发挥作用。有病理研究发现因心肌梗塞死亡的病人冠状动脉粥样硬化斑块破裂处的血管外膜周边存在着大量的肥大细胞，且大多呈被激活脱颗粒后状态，这表明肥大细胞与斑块的发展进程密切相关。祖国传统医学中医对于AS发生机制的解释归结为“痰瘀互结证”。AS初期病变脂质条纹、内膜下泡沫细胞集聚即为痰浊阻滞、痰凝不散之具体体现;AS后期斑块破裂，血小板激活以及高凝血状态、血栓形成视为血瘀证范畴。我院吴宗贵教授主持研制的“痰瘀同治”方药(Eliminating Sputum andRemoving Stasis Formulation)在前期研究中已经证明具有改善新西兰兔高脂血症、调控小鼠T细胞免疫等作用。本试验目的是借助ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块模型，探究“痰瘀同治”方药如何通过调节肥大细胞功能改善斑块的机制。
　　研究方法:
　　1、ApoE-/-小鼠AS斑块模型的建立与评估:选用6-8周龄雄性ApoE-/-小鼠为研究对象。(1)建模:首先行小鼠左颈动脉分支限流术，造成局部血液涡流状态;一周后行左肾动脉狭窄术，引发肾血管性高血压。术前和手术期间给予普通饮食喂养，左肾动脉狭窄术后第2天开始给予高脂饲料喂养直至第12周实验终点。(2)模型效果评估:建模第4周对小鼠进行颈动脉插管测量动脉收缩压及小动物血流多普勒超声检测颈动脉血流峰速情况，试验终点比较颈动脉斑块负荷程度三个方面来评估小鼠AS斑块模型制备情况。
　　2、“痰瘀同治”方药调控肥大细胞功能改善动脉粥样硬化斑块的机制研究:将小鼠随机分为空白对照组(CON)、单纯模型组(MOD)、阿托伐他汀组(ATO)、“痰瘀同治”方药组（ERF），每组10只。饲以高脂饲料喂养同时灌胃给药，12周实验终点采用主动脉内膜大体油红o染色比较斑块面积;主动脉根部冰冻切片油红染色比较斑块内脂质负荷面积;胆固醇及甘油三酯液体单试剂检测盒（酶法）检测总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)水平;快速蛋白液相色谱法(FPLC)检测小鼠血浆脂蛋白含量;比色法测定血清类胰蛋白酶活性;主动脉根部冰冻切片甲苯胺蓝染色比较血管外膜周边肥大细胞聚集脱颗粒情况;荧光实时定量PCR(PolymeraseChain Reaction)和免疫印迹实验(Westem blot)测定肥大细胞相关蛋白和血浆炎症因子表达情况。
　　研究结果:
　　1、ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块模型的测评
　　(1)小鼠颈动脉插管测量动脉收缩压:ApoE-/-小鼠采用颈动脉插管法检测动脉收缩压，测得对照小鼠收缩压平均为108.9±9.8mmHg，其余模型小鼠收缩压平均为154.5±9.1 mmHg，模型小鼠之间收缩压差异无统计学意义。
　　(2)小鼠颈动脉多普勒超声测量血流峰值:同对照组（627.52±44.82 mm/s）相比较，结扎后4周（205.72±36.84 mm/s）模型小鼠左颈动脉血液流速收缩期峰值(peak systolic velocity，Vmax)明显下降。模型小鼠之间颈动脉血液流速收缩期峰值差异无统计学意义。
　　(3)小鼠颈动脉冰冻切片苏木精依红染色(HE)及油红o染色:较对照组(539.32±58.92×103um2)，模型组小鼠（790.59±92.12×103um2）颈动脉切片斑块负荷面积明显增加。以上结果提示，局部颈动脉低切应力(LSS)及肾血管性高血压诱导可加速小鼠动脉粥样硬化的形成及发展。
　　2、“痰瘀同治”方药调控肥大细胞功能改善动脉粥样硬化斑块的机制研究:“痰瘀同治”方组较阿托伐他汀组降低小鼠血浆TC水平效果更为明显，其血浆TG、血浆低密度脂蛋白（LDL）、血清类胰蛋白酶含量较模型组亦显著下降。主动脉血管组织肥大细胞相关蛋白:白三烯C4合成酶(LTC4S)、组氨酸脱羧酶(HDC)、类糜蛋白酶1(CMA1)、类胰蛋白酶6（MCT6）与血浆肿瘤坏死因子（TNF-α）、转化生长因子β1(TGF-β1)在阿托伐他汀组和“痰瘀同治”方组之间存在显著差异。主动脉内膜大体油红o染色和主动脉根部冰冻切片油红o及甲苯胺蓝染色显示模型可加速动脉硬化粥样斑块形成，促使肥大细胞在动脉血管外膜聚集脱颗粒，“痰瘀同治”方药可减少动脉血管内斑块负荷面积，降低斑块内脂质负荷水平，削弱肥大细胞在动脉外膜处的聚集和脱颗粒程度，从而达到改善动脉粥样硬化斑块的作用。
　　研究结论:
　　1、ApoE-/-小鼠颈动脉分支限流合并肾动脉狭窄手术模型通过高脂饲料喂养可成功诱导动脉粥样硬化斑块形成;
　　2、“痰瘀同治”方药、阿托伐他汀在减少动脉血管内斑块负荷面积，降低斑块内脂质负荷及血浆TG、LDL水平方面效果相当;
　　3、相比阿托伐他汀，痰瘀同治”方药改善ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的机制可能与其进一步降低血浆TC，抑制肥大细胞在动脉血管外膜处聚集、脱颗粒以及调节血浆炎症因子TNF-α、TGF-β1等相关。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词表

前言

第一部分 ApoE-／-小鼠动脉粥样硬化斑块模型的建立与评估

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二部分 “痰瘀同治”方药调控肥大细胞功能改善动脉粥样硬化斑块的机制研究

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

综述 肥大细胞在动脉粥样硬化治疗方面的进展方向

本课题受以下基金资助

在读期间主要学术活动

致谢