死亡受体5在结肠癌组织的表达及抗死亡受体5新型人源抗体的筛选和鉴定

摘要

背景：近年来，罹患结肠癌的患者越来越多。虽然目前临床诊疗技术逐步提高，手术方式日趋完善，化疗、放疗等辅助综合手段不断发展，但结肠癌的治愈率和术后5年生存率并没有得到显著的提高。近些年来，肿瘤生物免疫疗法受到大家越来越多的关注，其具有靶向性、高效性及低毒性等优势，不久的将来有可能成为对抗肿瘤的一把新利器，在治疗中占据主导地位。死亡受体5（death receptor5，DR5）属于肿瘤坏死因子受体(Tumor Necrosis Factor receptor，TNFR)超家族成员，主要分布于多种肿瘤细胞的表面，在正常细胞很少或几乎不表达，当DR5与其配体肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）结合后，激活caspase-3，特异性诱导敏感肿瘤细胞凋亡，这些特性使得DR5成为肿瘤生物治疗的重要靶点。
　　噬菌体抗体库技术是20世纪90年代建立的一种制备人源抗体的新技术。该技术绕过了以往单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)研制过程中必经的杂交瘤途径，甚至不需要经过免疫。随着雅培公司运用噬菌体呈现技术获得的治疗风湿性关节炎的全人源抗体Humira等进入市场，噬菌体抗体库技术已成为研发治疗性抗体的重要平台。
　　目的：免疫组织化学法探究DR5在正常结肠、结肠管状腺瘤以及结肠管状腺癌三者间的表达情况有无差异;在结肠管状腺癌中的表达是否与性别、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、病理大体分型、组织学分型及TNM临床预后分期有关。初步判断DR5能否作为肿瘤生物免疫治疗中一个潜在的良好靶点，是否与肿瘤的临床病理特征相关，为未来肿瘤的个体化治疗及相关抗体药物的临床试验提供初步线索。然后从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗DR5人源单链抗体(single chain Fv，scFv)并对其抗原结合活性进行鉴定，为进一步研究该抗体抗肿瘤的生物免疫学作用机制奠定基础。
　　方法：用HE染色确认实验样本的病理学诊断，免疫组织化学方法检测DR5在正常结肠、结肠管状腺瘤、结肠管状腺癌以及结肠黏液腺癌中的表达情况;以前期真核表达纯化的DR5-Fc蛋白包被筛选管，从自主构建的大容量天然噬菌体抗体库中，通过4轮筛选过程获得噬菌体抗体，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达获得可溶性抗体，采用ELISA、免疫细胞化学及免疫组织化学法鉴定抗体的抗原结合活性，DNA指纹图谱分析和序列测定确定其抗体类型。
　　实验结果：
　　1.DR5在正常结肠、结肠管状腺瘤及结肠管状腺癌组织中的表达结肠正常组织中DR5的表达较结肠管状腺瘤和结肠管状腺癌均低，结肠管状腺癌以及结肠管状腺瘤组织中DR5相对高表达，但管状腺癌与腺瘤之间DR5的表达没有统计学差异。
　　2.DR5的表达水平与结肠管状腺癌临床病理特征的关系DR5在结肠管状腺癌组织中的表达情况与患者的性别、肿瘤的大小、大体类型、组织学分型、浸润分期、有无淋巴结转移均无明显关系，仅仅与肿瘤的TNM临床预后分期有关，DR5在结肠管状腺癌晚期及终末期（Ⅲ、Ⅳ期）中的表达较早中期(Ⅰ、Ⅱ期)有明显的下降趋势。
　　3.利用大型天然噬菌体抗体库筛选抗死亡受体5人源抗体经过4轮筛选，噬菌体抗体得到明显富集。从后两轮库中随机挑选80个单菌落，噬菌体诱导表达。ELISA检测，结果显示有59个与DR5-Fc有结合活性，阳性率为73.6％，其中特异性结合的克隆为46个。46个噬菌体阳性克隆制备可溶性scFv，其中有26个克隆与DR5-Fc特异性结合。
　　4.对阳性克隆的进一步分析26个阳性克隆的DNA MvaⅡ酶切后聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，共获得了4种不同的指纹图谱。对4种不同阳性克隆测序结果分析，4个抗体基因来源于不同的胚系，其中轻链可变区同属于VK3、VL1、VL2亚群，而重链可变区基因分属VH1，VH3亚群。
　　5.细胞ELISA、免疫细胞化学及免疫组织化学鉴定筛选抗体的抗原结合活性4种阳性克隆的噬菌体抗体及可溶性抗体均能与细胞中表达的DR5蛋白特异性结合。
　　实验结论:
　　1.DR5在正常结肠组织中低表达，在结肠癌组织中高表达，两者的表达情况有显著性差异性，提示DR5具备成为肿瘤未来生物免疫治疗中一个潜在的良好靶点。
　　2.DR5在结肠管状腺瘤中的表达较正常结肠组织有明显升高的趋势，提示DR5在癌前病变形成早期可能发挥着一定的作用。
　　3.DR5在结肠管状腺癌早中期有着高表达，而在晚期及终末期癌组织的表达量有明显下降的趋势，这为未来DR5抗体药物的临床试验及肿瘤的个体化治疗提供了初步线索。
　　4.利用新型大容量天然噬菌体抗体库，通过筛选及鉴定能快速获得特异性抗DR5人源scFv。
　　5.4种基因型阳性克隆的噬菌体抗体及可溶性抗体具备良好的细胞结合活性。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 死亡受体5在结肠癌组织的表达

一、材料和方法

(一)研究对象

(二)实验材料

(三)实验方法

(四)统计学分析

二、结果

(一)实验样本的临床资料统计

(二)HE染色结果

(三)免疫组织化学染色结果

(四)DR5在结肠管状腺癌、腺瘤及正常组织中的表达情况

(五)DR5的表达与结肠管状腺癌临床病理特征的关系

(六)DR5在结肠管状腺癌和黏液腺癌组织中的表达情况

(七)DR5在结肠腺癌组织周围血管中的表达情况

三、讨论

第二部分 抗死亡受体5新型人源抗体的筛选和鉴定

一、材料和方法

(一)实验用细胞、病毒及抗体库

(二)实验材料

(三)实验方法

(四)统计学分析

二、结果

(一)大容量噬菌体工作库的制备结果

(二)抗DR5人源抗体的筛选

(三)可溶性DR5 scFv的表达

(四)抗体可变区基因的扩增及DNA指纹分析

(五)DR5 scFv抗体可变区基因序列分析

(六)结肠癌SW480细胞ELISA检测结果

(七)免疫细胞化学法

(八)免疫组织化学法

三、讨论

参考文献

附录 全文总结

综述 死亡受体5和肿瘤生物治疗

在读期间论文发表及科研情况说明

致谢