阳离子脂质体通过抑制晚期自噬流导致细胞死亡

摘要

阳离子脂质体作为非病毒载体被大量应用于基因治疗，目前为止已经有两个相关临床试验已经开展，分别是治疗肺泡囊性纤维化和难治性白血病的研究，很不幸的是这些临床试验因为难以预料的相关致死性副作用而未能如期进入二期临床试验或者在病人招募阶段遇到困难。于是探索其毒性机制变得尤为关键。目前检索到的关于阳离子脂质体细胞毒性的文章有一篇15年1月份发表在cellreasearch的研究报道了阳离子脂质体通过损坏Na+/K+-ATP酶泵的作用而导致细胞坏死，但是作者依然认为需要更多的研究去阐明阳离子脂质体的生物学效应，继续检索文献发现阳离子脂质体对自噬流的影响发现有2个研究报道:Roberts R发现阳离子脂质体引发自噬，Man N等发现阳离子脂质体激活自噬是mTOR非依赖的。需要注意的是自噬流是一个动态过程，也就是说自噬流可能在一段时间区间内激活阻断交替出现，预示着应该多个时间点来评估自噬，所以，假设阳离子脂质体可能是动态调控自噬的:也就是阳离子脂质体早期激活自噬流然后晚期将其阻断，阳离子脂质体产生的细胞毒性是由于其抑制了自噬这一肿瘤细胞的自我保护机制。
　　为了阐明阳离子脂质体细胞毒性的潜在机制，细致研究了阳离子脂质体细胞毒性，阳离子脂质体对人肝脏表皮细胞系（因为大部分纳米颗粒主要累计在肝脏）自噬流的影响。
　　本文的研究内容分为四个部分:(1)制备表征优异的阳离子脂质体，并可以导致细胞坏死。(2)揭示阳离子调控自噬流的过程是动态的。(3)探索阳离子脂质体阻断晚期自噬流的机制(4)说明细胞毒效应至少和阻断自噬导致的损伤有关。
　　第一部分，本实验室纳米脂质体制备工艺成熟，采用薄膜分散法制备产生的纳米脂质体通过马尔文动态扫描显示脂质体粒径大小为166.13±6.2 nm且分布结果优异，PDI系数0.11±0.05，阳性电荷为36.57±3.27 mv。通过TEM可以看到阳离子脂质体为球形，双层膜结构，大小大约100 nm左右。接着将阳离子脂质体作用于细胞后发现细胞活性下降，且这种下降不是抑制细胞增殖而是导致细胞死亡引起的。
　　第二部分，揭示阳离子调控自噬流的过程是动态的。前人的研究显示阳离子脂质体可以激活自噬，首先通过WB(western blot)试验重复出来了这一结果，但是随着时间的进行，发现阳离子脂质体最终是阻断自噬的，这种调控是mTOR(mechanistic target of rapamycin)非依赖的。为了验证这一发现，使用LC3串联RFP和GFP的双荧光蛋白(RFP-GFP-LC3 Tandem mRFP/mCherry-GFP fluorescence)来检测自噬流，结果和WB一直，为了再次验证阳离子最终阻断自噬，通过加入自噬阻断剂CQ(chloroquine)后通过WB和Cyto-ID(CYTO-ID Autophagy Detection Kit)来验证，结果证实了阳离子脂质体晚期的确是阻断自噬流。
　　第三部分，探索阳离子脂质体阻断晚期自噬流的机制。通过LC3-GFP和Lysotraker-red染色后共聚焦拍摄观察到自噬流的融合受到了影响，然后通过电镜发现溶酶体变肥大，肿胀，同时线粒体嵴膜结构消失，和大量自噬小体的产生，为了进一步说明溶酶体发生了哪些变化，我们同过Acridine orange(AO)染色和LysoSensor Green DND-189染料发现溶酶体内酸性环境被碱性化，接着通过多功能酶标仪发现溶酶体的酸性磷酸酶活性下降，说明其降解能力下降。
　　第四部分，说明细胞毒效应至少和阻断自噬导致的损伤有关。已经有研究报道了阳离子脂质体可以导致溶酶体膜渗透性增加，导致蛋白激酶cathepsinB释放出来，然后损伤线粒体和导致活性氧上升，引起细胞死亡。为了验证这一机制，接着通过MitoTracker green(MTR green)和CM-H2DCFDA green(ROS green)标记发现了阳离子脂质体可以导致细胞的线粒体发生功能障碍和活性氧上调，最终导致细胞死亡，这种调控机制可以被SiRNA-ATG7基因干扰和自噬阻断剂再现，并且可以被活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸NAC部分逆转。说明阳离子脂质体导致的细胞死亡至少和自噬流的阻断相关。
　　综合上述，研究揭示了阳离子脂质体通过阻断自噬引起细胞毒性，同时伴随线粒体损伤和ROS上调。我们的研究可以帮助以后评估纳米颗粒的生物兼容性以及设计更好的基因递送载体有更好的意义。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 脂质体可以降低细胞活性，导致细胞死亡

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与结果讨论

第二部分 阳离子脂质体调控自噬流的过程是动态的

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与结果讨论

第三部分 阳离子脂质体通过影响自噬小体和溶酶体融合阻断自噬

一、实验仪器和材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与结果讨论

第四部分 阳离子脂质体的细胞毒效应至少和阻断自噬导致的损伤有关

一、实验仪器和材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与结果讨论

全文小结

综述 纳米颗粒在自噬研究中的新进展

参考文献

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢