尿液lncRNA在前列腺癌早期诊断以及新型miRNA在进展机制中的研究

摘要

中国前列腺癌(Prostate cancer，PCa)的发病率和死亡率急剧上升，其增长率位居肿瘤之首。同时，PCa的防治面临着两大临床难题，即早期诊断指标特异性差和晚期治疗方法效果不佳。因此，临床上亟需找到新型的敏感性和特异较高的PCa诊断标志物或诊断策略来代替血清PSA或弥补血清PSA在早期诊断上的不足；基础研究上亟需阐明PCa进展的关键分子机制，从而研发出抑制去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer，CRPC)的新型药物，实现CRPC治疗上的突破。
　　研究目的:
　　研究尿液中长链非编码RNA MALAT1和PCA3评分在前列腺初次穿刺患者中的诊断作用，建立基于尿液MALAT1或PCA3评分的综合诊断模型；探索新型miR-n5在PCa进展中的作用机制，寻找CRPC干预的新靶点。
　　研究方法:
　　全转录组扩增试剂盒扩增尿沉渣RNA，qRT-PCR检测MALAT1和PCA3的表达，单因素logistic回归预测PCa的危险因素，多因素logistic回归建立PCa诊断模型，Spearman rank检测分析尿液MALAT1或PCA3评分与其它临床变量之间的关系，运用受试者工作曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)确定诊断指标的曲线下面积（Area under the ROC，AUC）、最佳截断值、特异度和敏感度，决策曲线分析(Decision curve analysis，DCA)来估算尿液MALAT1和PCA3评分的临床价值。Northern blot检测新型miRNA的存在与表达，细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成实验来评价miR-n5在进展性PCa细胞系中的生物学功能，生物信息学软件预测miR-n5的靶基因，双荧光素酶报告基因法验证靶基因，GraphPad Prism5进行数据展示并计算药物的IC50，皮下种植和胫骨内注射建立CRPC小鼠移植瘤模型。用SPSS v.17.0(SPSS Inc.，Chicago, IL, USA), MedCalc v.10.4.7.0(MedCalc Software bvba, Mariakerke, Belgium)和R软件包v.3.1.1(The R Foundation for Statistical Computing)对数据进行统计学分析，运用HemI软件进行数据的Heatmap分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　研究结果:
　　尿液MALAT1和PCA3评分可以明确区分肿瘤组和穿刺阴性组患者并与PCa的检出率高度相关，但进一步的相关性分析发现，尿液MALAT1和PCA3评分与临床危险因素以及Gleason评分没有相关性。年龄、血清总PSA(Total PSA，tPSA)、前列腺体积(Prostate volume，PV)、游离PSA比值（Percentage of free PSA，％fPSA）和直肠指诊结果（Digital rectal examination，DRE）是总体人群的独立预测因子，而在PSA=4-10ng/ml（PSA“诊断灰区”）人群中，年龄、PV、％fPSA和DRE是其独立预测因子。尿液MALAT1评分在总体人群中的PCa诊断效能与tPSA相比虽然稍高但没有统计学意义(p=0.510)，但在PSA“诊断灰区”人群中则明显优于tPSA(p=0.034)。PCA3评分在PSA“诊断灰区”人群中的PCa诊断效能则明显优于tPSA(p=0.0407)和％fPSA(p=0.046)。进一步的logistic回归分析得出，在发现组的PSA“诊断灰区”人群中，基于尿液MALAT1评分综合模型的预测准确性为79.79％和AUC为0.853，预测准确性比基础模型提高了5.32％，AUC提高了0.0318。将这一模型应用到验证组也得到了相同的结果。同样，在PSA“诊断灰区”人群中，基于尿液PCA3评分综合模型的AUC也高达0.819，高于基础模型的0.788。
　　应用DCA，在PSA“诊断灰区”人群中，不管是在发现组还是在验证组，基于尿液MALAT1评分综合模型的临床预测能力都优于基础模型。将临床穿刺风险定为25％，发现组人群中基于尿液MALAT1评分综合模型的总获益率高于基础模型(13.97％ vs.11.47％)，且可以避免更多不必要的前列腺穿刺(47.32％ vs.39.78％)；验证组人群基于尿液MALAT1评分综合模型的总获益率同样高于基础模型(15.73％ vs.13.11％)，且可以避免更多不必要的前列腺穿刺(30.33％ vs.22.47％)，更为重要的是，综合模型没有漏诊1例高级别PCa而基础模型则漏诊1例高级别PCa。同样，在PSA“诊断灰区”人群中，基于PCA3评分综合模型几乎在所有临床穿刺阈值上优于基础模型，特别是在25％-40％这一区间显示出了更好的预测作用。应用30％这一临床穿刺阈值，基于PCA3综合模型可以避免60.3％不必要的穿刺活检，但以漏诊4例PCa为代价，其中2例为高级别PCa。
　　此外，应用65对PCa及其癌旁正常组织进行RNA-seq发现300多个新型miRNA，并使用Northern blot验证了其中表达量最高的8个新型miRNA。通过在进展性PCa与惰性PCa细胞系中的表达情况比较，筛选出4个与PCa进展相关的新型miRNA。再通过临床样本的验证，最终选取miR-n5作为后续的研究对象。体外的功能实验表明，miR-n5能够明显抑制进展性PCa细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力，说明miR-n5的缺失或低表达可能促进了PCa的进展。进一步的体内实验证明了肿瘤内注射miR-n5能够抑制小鼠移植瘤的生长。此后，生物信息学分析并找到了miR-n5的作用靶基因KDM6B，同时，通过双荧光素酶报告基因及qRT-PCR进行验证。进一步的研究表明，KDM6B的特异性抑制剂——小分子化合物GSK-J4能够抑制KDM6B的活性并明显抑制PCa细胞的生长，体内实验也证明了这一小分子化合物能够明显抑制小鼠移植瘤的生长。
　　研究结论:
　　尿液MALAT1和PCA3是PCa的独立预测因子，能明确区分前列腺穿刺阳性和阴性患者，基于尿液MALAT1或PCA3建立的临床综合诊断模型可大大提高PCa的临床诊断效能。尤其在PSA“诊断灰区”，尿液MALAT1和PCA3的诊断效能明显高于血清总PSA，基于尿液MALAT1或PCA3建立的临床综合诊断模型的预测能力高于应用临床危险因素建立的基础模型，并能够避免更多不必要的前列腺穿刺且不会漏诊更多的高级别PCa。此外，本研究证明了miR-n5在体内和体外都能明显抑制进展性PCa的生长，它通过抑制其靶基因KDM6B的表达发挥抗肿瘤作用。同时，GSK-J4能够抑制miR-n5的靶基因KDM6B的活性并明显抑制PCa细胞的生长。新型miR-n5有望成为一个新的CRPC干预的靶点，而GSK-J4也有望成为治疗进展性PCa的一种新型靶向药物。

目录

声明

摘要

英文缩略词

前言

第一部分：尿液长链非编码RNA用于前列腺癌早期诊断的研究

一、课题设计

二、材料和方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

第二部分：新型miRNA在前列腺癌进展中的作用机制研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

参考文献

文献综述

在读期间发表论文和科研工作

致谢