基于转录组芯片筛选的新型LncRNA在CAD早期诊断中的作用及分子机制研究

摘要

本文内容从两个部分进行了论述
　　第一部分
　　研究背景和目的:
　　近来CAD被认为是一种慢性炎性疾病，主要累及大-中肌型动脉，以动脉粥样硬化斑块形成为特征。已有研究证实在外周血中占粒细胞总数约5-10％的单核细胞在AS形成这一病理过程中发挥重要作用。本课题将系统地研究CAD病人单核细胞在转录组表达谱的变化，筛选新型CAD相关的长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，建立早期诊断CAD的“lncRNA分子诊断模型”，并对该模型的准确性和有效性进行验证。在此基础之上，研究其生物学功能，全面评估其在CAD发生发展中的作用。
　　方法:
　　第一章
　　本研究共入选了502例在本科介入中心接受冠脉造影的CAD及对照患者，病人的相关临床资料完整。采用lncRNA表达谱芯片对15例男性CAD病人和15例男性对照患者单核细胞和血浆进行研究，采用实时定量PCR方法在相同的单核细胞样本里验证了芯片结果，接着我们又在另一个20×20的人群对筛选的3个lncRNAs进行了验证及ROC曲线分析。我们进一步扩大样本量(211×171)对CoroMarker与CAD之间的关系进行病例对照研究，并随机抽样分为训练样本161×121和验证样本(50×50)，根据训练样本构建“CoroMarker分子Fisher判别模型”，同时对对照研究人群、训练样本和验证样本分别进行ROC曲线分析和危险因素分析。同时，在一个独立人群(50×40)进行前瞻性的诊断研究。最后，在不同心血管疾病中对其特异性检测。
　　第二章
　　根据芯片结果，筛选差异基因并对其进行GO、Pathway、共表达网络及功能富集分析，同时，在体外应用电转的方法，特异性siRNA敲降CoroMarker的表达，观察THP-1细胞增殖及炎性细胞因子分泌等生物学行为的变化。
　　结果:
　　第一章
　　根据lncRNA表达谱芯片结果，我们成功筛选到51个在CAD病人单核细胞和血浆中同时高表达的lncRNAs，进一步筛选出其中5个差异显著高丰度表达的lncRNAs，在(20×20)人群中，采用qPCR及ROC曲线分析方法分析得到在CAD病人单核细胞中高表达的3个lncRNA（CoroMarker，IL21R和BAT5），AUC分别为0.94、0.825和0.818，故确定CoroMarker为研究对象。在接下来的临床大样本(211×171)验证过程中，根据最优抽样效果构建CoroMarker的Fisher判别模型，Fisher判别函数:f=-3.05212x+4.648898。x为CoroMarker的表达值，当x＞=1.523时，该个体就是CAD患者，x＜1.523时，则为非CAD患者。样本集模型（100次抽样对应的100个模型）判断结果提示:平均正确判别率为0.81，最大正判率为0.89，最小正判率为0.74;其中，冠心病组平均正判率为0.65，最大正判率为0.82，最小正判率为0.50;而对照组平均正判率为0.97，最大正判率为1.00，最小正判率为0.90。冠心病平均正判32例，误判为对照组18例;对照组平均正判48例，误判为冠心病2例。该模型判断最优结果提示:分类总正判率为0.89，其中冠心病组达到0.80，对照组高达0.98。冠心病组正判40例，误判为对照组10例，对照组正判高达49例，误判为冠心病只有1例。而ROC分析结果表明总体样本中AUC为0.92，95％CI(0.892-0.947)，而第15次抽样对应的训练样本及验证样本中AUC分别为0.905，95％ CI(0.869-0.940)和0.96，95％ CI(0.923-0.997)。危险因素分析结果提示CoroMarker不受CAD传统危险因素的影响，单因素及多因素分析结果提示CoroMarker可作为诊断CAD的独立危险因素。独立前瞻性研究结果提示，该模型能够分别在50例CAD病人中正判38例，在40例对照组患者中正判37例，相应的敏感性和特异性分别为76％和92.5％。相较其他的心血管疾病，CoroMarker在CAD中特异性高表达。
　　第二章
　　Pathway分析提示，冠心病组外周血单核细胞上调差异基因主要参与Jak-STAT signaling pathway，Vascular smooth musclecontraction，Leukocyte transendothelial migration和Metabolic pathways等细胞信号转导途径，而下调差异基因主要参与Rheumatoid arthritis，Chemokine signalingpathway, Toll-like receptor signaling pathway, Antigen processing and presentation,Metabolic pathways和Apoptosis等与炎症、免疫和凋亡相关的细胞信号转导途径。
　　结论:
　　(1)首次筛选出CAD病人单核细胞高表达的CoroMarker。
　　(2)建立了lncRNA的“CoroMarker分子诊断模型”，可早期预测CAD的发生发展。
　　(3) CoroMarker可通过促进单核细胞增殖和分泌炎性细胞因子导致CAD的病理形成。
　　第二部分
　　研究背景和目的:
　　在第一部分研究工作中，我们证实单核细胞高丰度表达的CoroMarker可作为早期诊断CAD的一个新型生物标志物;在功能初步验证中，研究分析CoroMarker可通过发挥促炎和促单核细胞增殖的作用导致CAD发生发展。
　　本实验的目的就是探讨CAD病人动脉血管内皮高丰度表达的CoroMarker在CAD病理形成中的作用及分子机制。
　　方法:
　　第一章
　　我们运用percoll液分选外周血循环内皮细胞，通过qPCR方法研究循环内皮细胞CoroMarker在CAD组和非CAD组之间的差异表达;在HUVEC细胞系上，构建稳转shRNA-CoroMarker细胞系; ELISA检测细胞培养上清液中相关炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNFα的分泌。
　　第二章
　　运用荧光原位杂交和核质分离的方法研究CoroMarker在内皮细胞中的亚定位;3，及5'RACE和northern blot的方法获取并验证CoroMarker的全长序列;生物信息学分析CoroMarker可能的作用，并用双荧光素酶报告基因的方法研究CoroMarker与mir205-5P的直接作用;Wester Blot及qPCR的方法研究基因在转录及转录后的表达。
　　结果:
　　第一章
　　qPCR结果表明CoroMarker在冠心病人循环内皮细胞上的表达(5.156±0.896)，95％CI(0.565，1.397)，较对照组患者循环内皮细胞上的表达(0.981±0.176)，95％CI(3.036，7.275)，显著升高(P＜0.05);对CoroMarker的功能进行研究，在成功干扰CoroMarker70％的时候，ELISA法检测细胞培养上清液中炎性细胞因子IL-1β、IL6和TNFα的结果提示CoroMarker干扰组IL-1β(P=0.0398)、IL6(P=0.000)和TNFα（P=0.017）的分泌较对照组和阴性对照组，皆显著降低(P＜0.05)，而IL-1β、IL6和TNFα在对照组和阴性对照组之间无明显差异(P＞0.05)，n=6。
　　第二章
　　荧光原位杂交实验结果提示，带cy3标记的CoroMarker主要集中在HUVEC细胞的胞浆中;核质分离实验的结果进一步证实胞浆中CoroMarker的表达是细胞核中的2.5倍。在HUVEC细胞上，分别通过3'和5'RACE，获取了CoroMarker的全长序列，共有1394nt;并通过Northern blot实验进一步证实CoroMarker基因条带对应在1500bp附近，和RACE结果一致。继而生物信息学分析提示CoroMarker可以和microRNA205-5P互补结合;qPCR研究结果表明干扰CoroMarker组microRNA205-5P的表达较对照组及干扰阴性对照组皆显著下降(P＜0.05);双荧光素酶报告基因实验结果提示，lncRNA可显著增强miR-205的表达(P＜0.05)，luciferase活性较对照组增强近2倍。qPCR及WB检测结果皆表明作为microRNA205-5P靶基因的PTEN在CoroMarker干扰组中显著上调，同时干扰PTEN可使CoroMarker促进炎性细胞因子的分泌得到部分恢复。
　　结论:
　　(1)首次成功鉴定出CAD的致病基因CoroMarker.
　　(2)首次证明CoroMarker主要分布在细胞浆中，并可直接调控microRNA205-5P的启动子。
　　(3)首次证明了CoroMarker-microRNA205-5P-PTEN这一信号通路在CAD发生发展中的作用。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一部分 单核细胞lncRNA作为诊断CAD新型分子标志物的筛选及其功能研究

第一章 前言

第二章 lncRNA-CoroMarker作为早期诊断冠心病的新型分子标志物的筛选，诊断模型的建立

2．1 材料和方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 CoroMarker的功能分析及验证

3．1 材料与方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

3．4 小结

第二部分 内皮细胞CoroMarker在CAD发生发展中的作用及分子机制研究

第一章 前言

第二章 内皮细胞CoroMarker在CAD发生发展中的作用及功能研究

2．1 实验材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 内皮细胞CoroMarker在CAD发生发展中的分子机制研究

3．1 材料与方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

3．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 RNA干扰疗法在心血管疾病中的应用

攻读博士期间发表的论文

致谢