PSMD4在内质网应激诱导的肝癌细胞凋亡中的作用及机制研究

摘要

目的:
　　原发性肝细胞癌是当前危害人类健康的恶性肿瘤之一，具有很高的发病率与死亡率。由于肝癌发病机制复杂，早期缺少有效的诊断方法，多数病人被诊断出肝癌时已属于中晚期，错过最佳的治疗机会。由于肝癌患者术后有较高的复发转移率而导致病人预后较差;同时，对于晚期不适合手术的肝癌患者，仅有索拉菲尼一种药物目前在临床使用，且治疗效果有限。因此，深入理解肝癌的发病过程与分子机制，针对肝癌患者实施个体化精准治疗，提高生存显得尤为重要。
　　细胞内质网是细胞内主要的亚细胞结构，主要负责蛋白质的组装、加工以及钙离子储存。当内质网中未折叠蛋白或错误折叠蛋白聚集时，细胞会启动未折叠蛋白反应，从而达到保护细胞的目的。持续性的未折叠蛋白反应，会导致细胞发生内质网应激，而过度的内质网应激则会诱导细胞凋亡。细胞发生内质网应激时，会激活未折叠蛋白反应及下游分子的表达，而这些分子中就包括ATF4（activating transcription factor4）。ATF4作为内质网应激未折叠蛋白反应信号通路中的节点分子，能够激活下游靶分子的表达，一方面促进未折叠蛋白反应的缓解，而在过度的内质网应激时则会促进细胞凋亡。而在肿瘤细胞中，尤其是肝癌细胞中，内质网应激引起细胞凋亡时，ATF4具体受何分子和方式调控则鲜有相关报道。
　　PSMD4基因编码的蛋白是26S蛋白酶体19S调节组分的一个调节亚基，又名RPN10，其结构中含有泛素蛋白作用模序，与泛素化蛋白相互作用，介导泛素化蛋白质的降解。相关研究发现，PSMD4基因的缺失对酵母的存活并不构成影响，而在高等生物中，PSMD4基因的缺失会影响其发育，如缺失PSMD4的小鼠胚胎在发育早期会出现死亡现象。PSMD4不仅在泛素化蛋白质的降解调控中发挥作用，也参与高等生物的发育过程，但其功能与作用机制尚不明确。在某些疾病的病程中，PSMD4的作用及具体的分子机制尚待阐明。我们前期发现了PSMD4在肝癌中高表达，并且与肝癌的恶性程度有关，但结论基于的临床肝癌样本较少，同时对于PSMD4在肝癌细胞凋亡尤其是内质网应激引起的凋亡中的作用及机制也少有探究。因此，在本研究中，我们通过扩大样本量进一步研究PSMD4在肝癌中的表达与病理、预后的关系，并借助肝癌细胞株、内质网应激模型等研究PSMD4对内质网应激引起的肝癌细胞凋亡的影响及分子机制。
　　方法:
　　1.收集肝癌样本，构建组织芯片并检测PSMD4在肝癌组织及癌旁组织中的表达;
　　2.整理分析肝癌样本病理及预后资料，研究PSMD4在肝癌中的表达与肝癌病理、预后的关系及其临床意义;
　　3.利用内质网应激诱导剂刺激、Western blot等技术，研究PSMD4对肝癌细胞凋亡的影响;
　　4.利用Western blot、免疫共沉淀等技术，研究PSMD4对ATF4的调控作用及其分子机制;
　　结果:
　　1.PSMD4组织芯片染色结果显示肝癌组织中PSMD4的表达水平高于癌旁组织;
　　2.肝癌中PSMD4的表达与肝癌病人的预后有关，PMSD4可以作为潜在的肝癌预后判断标志物;
　　3.PSMD4能够增强肝癌细胞对内质网应激引起的凋亡的敏感;
　　4.PSMD4通过caspase-8促进肝癌细胞对内质网应激引起的凋亡敏感;
　　5.PSMD4不影响ATF4的转录，但能够抑制其降解从而稳定ATF4蛋白的表达;
　　6.PSMD4能够促进ATF4在细胞核内的聚集。
　　结论:
　　本课题研究发现，在HCC病人的癌组织中，PSMD4的表达明显高于癌旁组织，通过分析整理临床肝癌病人样本的病理资料，发现PSMD4的高表达与临床病理指标具有相关性，进一步通过生存分析发现PSMD4的表达与病人总体生存及复发有关，同时还发现PSMD4在肝癌中的表达可以作为独立的复发预测因素，表明肝癌中PSMD4的表达水平具有临床预后判断价值。同时在细胞株研究中，我们还发现PSMD4能够增强肝癌细胞对内质网应激引起的凋亡敏感，并且这一过程是通过促进caspase8的活化完成的，进一步的机制研究发现，PSMD4引起的内质网凋亡敏感性增加是通过抑制ATF4的降解完成的。我们的研究不仅阐明了PSMD4在内质网应激引起的肝癌细胞凋亡中的作用，还探索了其中潜在的机制，完善了PSMD4在肝癌中的调控网络并提示了PSMD4在肝癌个体化治疗中的潜在价值。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

材料方法

一、材料

二、仪器设备

三、实验方法

实验结果

一、PSMD4在肝细胞癌组织及癌旁组织中的表达及临床意义

二、PSMD4增强肝癌细胞对内质网应激引起的凋亡敏感

三、PSMD4通过caspase8促进肝癌细胞对内质网应激引起的凋亡敏感

四、PSMD4通过稳定ATF4的表达促进肝癌细胞凋亡

五、PSMD4不影响ATF4的转录

六、PSMD4抑制ATF4的降解

七、PSMD4促进ATF4在细胞核内聚集

八、PSMD4与ATF4相互作用研究

九、PSMD4与ATF4间调控关系的深入探索

讨论

参考文献

综述 内质网应激与肿瘤

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢