长链非编码RNA FOXD3-AS1在脑胶质瘤中的表达及功能研究

摘要

脑胶质瘤是成人中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤，在所有原发性颅内肿瘤中占的比例超过40％。尽管近年来针对胶质瘤的传统治疗手段，包括外科手术切除、放疗和化疗均取得了巨大的进步，但是胶质瘤患者的总体预后仍不甚理想。人们开始认识到胶质瘤的发生发展是一个多基因参与、多分子调控的复杂过程。越来越多具有促癌或抑癌作用的分子已经被证明参与了胶质瘤的发生发展过程，然而其确切的分子机制仍不清楚。因此，探索胶质瘤发生发展的特异性分子机制，为挑选能够预测胶质瘤预后的生物标志物，并寻求新的治疗策略成为了神经外科研究的热点。
　　长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200个核苷酸、并不能编码蛋白质的RNA。LncRNA起初被认为是转录噪音，但是越来越多的研究已经证明lncRNA在包括癌症在内的人类疾病中起着重要的调控作用。所以，有理由推测lncRNA有可能成为肿瘤基因治疗的一个新的靶点。与siRNA、miRNA等为代表的小RNA不同，lncRNA能够在转录前、转录后以及表观遗传学等多个水平调控下游基因的表达。近年来有研究报道，许多lncRNA与它临近的基因相互作用，组成“lncRNA-mRNA”对的形式起作用。
　　前期的芯片数据结果表明，FOXD3-AS1在胶质瘤中存在异常表达。但是，目前尚未有关于FOXD3-AS1方面的研究。
　　本实验首先确定FOXD3-AS1在人脑胶质瘤组织中的表达特点，通过统计学方法分析FOXD3-AS1表达水平与临床病例资料及患者预后之间的关系。然后通过一系列体外细胞功能实验，进一步观察FOXD3-AS1在胶质瘤细胞系中的功能。再通过检测其临近基因FOXD3在胶质瘤组织中的表达情况，证明FOXD3-AS1与FOXD3的关系，并通过敲减胶质瘤细胞系中FOXD3-AS1的表达量，观察其中FOXD3的表达水平变化，初步探索FOXD3-AS1可能的作用机制。本实验共分为四个部分:第一部分，长链非编码RNA FOXD3-AS1在人脑胶质瘤中的表达研究;第二部分，下调FOXD3-AS1的表达对胶质瘤细胞系生物学特性影响的研究;第三部分，FOXD3-AS1靶基因的筛选及验证其在人脑胶质瘤中的表达研究;第四部分，FOXD3-AS1与FOXD3在人脑胶质瘤中的相关性研究。
　　第一部分 长链非编码RNA FOXD3-AS1在人脑胶质瘤中的表达研究
　　目的:初步研究FOXD3-AS1在脑胶质瘤组织及正常脑组织中的表达情况，结合临床病例资料，分析FOXD3-AS1的表达量与患者各临床指标之间的关系。
　　方法:在44例胶质瘤组织及6例正常脑组织标本中，采用q-PCR法检测FOXD3-AS1在其中的表达情况，利用统计学方法分析FOXD3-AS1表达水平与患者各临床指标及预后的相关性。
　　结果:FOXD3-AS1在高级别胶质瘤中的表达量显著高于其在低级别胶质瘤和正常脑组织中的表达量，差异具有统计学意义(P＜0.01)。FOXD3-AS1在低级别胶质瘤组织中的表达量与正常脑组织中表达量无明显差异。临床病例资料统计分析结果显示FOXD3-AS1的表达水平与胶质瘤级别呈正相关(P=0.003)。Kaplan-Meier生存分析显示FOXD3-AS1的表达水平与患者总生存时间呈负相关(P＜0.001);同样在高级别胶质瘤组织中，FOXD3-AS1的表达水平与患者总生存时间呈负相关(P＜0.05)。多因素COX回归分析发现，FOXD3-AS1的高表达是胶质瘤患者预后的独立危险因素。
　　结论:FOXD3-AS1的表达随着胶质瘤级别的升高而升高，并与患者的预后呈显著负相关，FOXD3-AS1是胶质瘤发病过程中的潜在致癌分子。
　　第二部分 下调FOXD3-AS1的表达对胶质瘤细胞系生物学特性影响的研究
　　目的:初步研究FOXD3-AS1在胶质瘤细胞系中的功能。
　　方法:设计合成FOXD3-AS1干扰序列，将其转染至胶质瘤细胞系U251和A172中，采用real-time PCR检测干扰效率。在FOXD3-AS1干扰序列转染U251和A172胶质瘤细胞系24小时后采用一系列细胞功能实验检测FOXD3-AS1下调对胶质瘤细胞生物学特性的影响。
　　结果:将FOXD3-AS1干扰序列转染U251和A172后，FOXD3-AS1表达量明显下降。细胞增殖实验（CCK-8）结果显示，敲减FOXD3-AS1后，U251和A172细胞的增殖能力明显下降;细胞周期实验结果提示，敲减FOXD3-AS1后能够引起U251和A172细胞发生S期阻滞，能够引起细胞周期相关蛋白发生变化;敲减FOXD3-AS1能够明显抑制U251和A172细胞的迁移和侵袭能力。
　　结论:FOXD3-AS1在胶质瘤的发生发展过程中可能起着促进其增殖、迁移、侵袭的作用。
　　第三部分 FOXD3-AS1靶基因的筛选及验证其在人脑胶质瘤中的表达研究
　　目的:挑选FOXD3-AS1可能的靶基因，初步检测其在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达情况，结合临床病例资料，分析其表达量与患者各临床指标之间的关系。
　　方法:通过生物信息学分析寻找FOXD3-AS1可能的靶基因，并在上述的44例胶质瘤组织及6例正常脑组织标本中，采用q-PCR、免疫组织化学技术和蛋白印迹法检测其在标本中的表达情况，利用统计学方法分析其表达水平与患者各临床指标及预后的相关性。
　　结果:FOXD3-AS1与FOXD3在基因序列中位置相关。FOXD3在高级别胶质瘤中的表达量显著高于其在低级别胶质瘤及正常脑组织中的表达量，差异具有统计学意义(P＜0.05)。FOXD3在低级别胶质瘤组织中的表达量与正常脑组织中表达量无明显差异。临床病例资料统计分析结果显示FOXD3的表达量与胶质瘤级别正相关(P=0.026)。Kaplan-Meier生存分析显示FOXD3的表达水平与患者总生存时间呈负相关(P＜0.01)。
　　结论:FOXD3的表达水平随着胶质瘤级别的升高而升高，并与患者的预后呈显著负相关，FOXD3是胶质瘤发病过程中的潜在致癌分子。
　　第四部分 FOXD3-AS1与FOXD3在人脑胶质瘤中的相关性研究
　　目的:初步研究FOXD3-AS1与FOXD3在胶质瘤组织中表达量的相关性，探索FOXD3-AS1在胶质瘤中起促癌作用可能的分子机制。
　　方法:采用皮尔森相关性分析法分析FOXD3-AS1和FOXD3在胶质瘤组织中表达量的相关关系，在U251和A172细胞中敲减FOXD3-AS1后，观察FOXD3蛋白水平是否发生变化。
　　结果:FOXD3-AS1与FOXD3在胶质瘤组织中表达正相关，在U251和A172细胞中下调FOXD3-AS1可以抑制FOXD3的表达。
　　结论:FOXD3-AS1可能是通过调节FOXD3的表达水平而起促癌作用的。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 长链非编码RNA FOXD3-AS1在人脑胶质瘤中的表达研究

引言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

第二部分 下调FOXD3-AS1的表达对胶质瘤细胞系生物学特性影响的研究

引言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

第三部分 FOXD3-AS1靶基因的筛选及验证其在人脑胶质瘤中的表达研究

引言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

第四部分 FOXD3-AS1与FOXD3在人脑胶质瘤中的相关性研究

引言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

全文总结

长链非编码RNA在脑胶质瘤中的研究现状

硕士期间文章及科研情况

致谢