Nrf--2信号通路在大鼠脓毒症急性肝损伤中的作用研究

摘要

目的:通过盲肠结扎穿孔法(CLP)建立大鼠脓毒症急性肝损伤(acute liverinjury，ALI)模型，以核因子E2相关因子2(Nrf-2)激动剂莱菔硫烷(SEN)、抑制剂全反式维甲酸(ATRA)干预CLP模型，验证Nrf-2转录活性，明确Nrf-2信号通路在脓毒症急性肝损伤时是否具有肝功能保护作用。
　　方法:SPF级SD大鼠共计128只，设置成假手术组、盲肠结扎穿孔组、莱菔硫烷组以及全反式维甲酸组。四组大鼠分别按时间点再次平均分成6h、12h、18h及生存分析组四个亚组。假手术组大鼠麻醉后，用1ml注射器根据体重按5ml/kg剂量给予腹腔注射溶剂玉米油后关闭大鼠腹腔。盲肠结扎穿孔组大鼠，在距离盲肠盲端1/4盲肠全长处用丝线结扎，然后用16G留置针在结扎段盲肠肠系膜对侧总长度的1/2和远端1/4点处各扎一孔，挤出部分肠内容物，按5ml/kg剂量腹腔注射玉米油后关腹。莱菔硫烷组和全反式维甲酸组分别在CLP建模后腹腔注射SFN(5mg/kg)、ATRA(1mg/kg)后关腹。各时间点经心脏采血，离心获取血清行转氨酶(ALT、AST)、总胆红素水平检测，处死大鼠后留取肝脏行组织形态学、炎症因子、抗氧化酶水平测定及Western-Blot法检测Nrf-2蛋白水平，RT-PCR法检测目的基因Nrf-2以及抗氧化酶基因表达水平。
　　结果:(1)大鼠血清AST、ALT、总胆红素值的变化:
　　建模后6h，盲肠结扎穿孔组、莱菔硫烷组及全反式维甲酸组大鼠AST、ALT和总胆红素值均较假手术组升高;莱菔硫烷组大鼠总胆红素值较盲肠结扎穿孔组降低，而全反式维甲酸组大鼠总胆红素值较盲肠结扎穿孔组升高;全反式维甲酸组大鼠转氨酶以及总胆红素水平均较莱菔硫烷组升高。
　　建模后12h及18h，盲肠结扎穿孔组、莱菔硫烷组及全反式维甲酸组转氨酶、总胆红素值均较假手术组显著升高;莱菔硫烷组数值较盲肠结扎穿孔组均有所降低，全反式维甲酸组数值较盲肠结扎穿孔组均有所升高;全反式维甲酸组数值较莱菔硫烷组则明显升高。
　　(2)肝组织外观及病理HE染色:各时间点假手术组大鼠肝脏大体形态正常，镜下观其结构轮廓清晰，未见明确病理改变。盲肠结扎穿孔组、莱菔硫烷组和全反式维甲酸组大鼠肝脏镜下可见不同程度损伤，且随时间延长呈加重趋势，在同一时间点莱菔硫烷组病理改变范围及严重程度较盲肠结扎穿孔组轻，全反式维甲酸组较盲肠结扎穿孔组重。
　　(3)肝组织匀浆炎症因子值的变化:建模后各时间点，盲肠结扎穿孔组、莱菔硫烷组、全反式维甲酸组大鼠肝脏组织匀浆炎症因子数值均较假手术组升高;莱菔硫烷组数值较盲肠结扎穿孔组下降，而全反式维甲酸组数值较盲肠结扎穿孔组有所升高，全反式维甲酸组数值较莱菔硫烷组则明显升高。
　　(4)肝组织匀浆抗氧化酶水平检测:
　　SOD活力检测结果:建模后6h时间点盲肠结扎穿孔组比假手术组SOD活力水平增高，18h时间点较其下降;各时间点菜菔硫烷组、全反式维甲酸组SOD值分别比假手术组以和盲肠结扎穿孔组升高、下降，全反式维甲酸组SOD值比莱菔硫烷组明显降低。
　　GSH-Px活力检测结果:盲肠结扎穿孔组与假手术组相比，建模后6h及12h时间点GSH-Px活力水平增高，18h时间点较其下降;各时间点莱菔硫烷组、全反式维甲酸组GSH-Px值分别比假手术组以和盲肠结扎穿孔组升高、下降，全反式维甲酸组GSH-Px值比莱菔硫烷组明显降低。
　　(5)肝组织中Nrf-2蛋白表达情况:各时间点盲肠结扎穿孔组、莱菔硫烷组肝脏Nrf-2蛋白表达水平均较假手术组增高;莱菔硫烷组较盲肠结扎穿孔组也有所升高;全反式维甲酸组在18h时间点较假手术组有所降低，同时各时间点全反式维甲酸组Nrf-2蛋白表达水平均较盲肠结扎穿孔组有所下降，较莱菔硫烷组明显降低。
　　(6)肝组织中Nrf-2 mRNA、GSH-PXmRNA、SODmRNA表达水平:
　　Nrf-2 mRNA:各时间点盲肠结扎穿孔组、莱菔硫烷组均较假手术组增高，同时莱菔硫烷组、全反式维甲酸组分别较盲肠结扎穿孔组升高、下降，全反式维甲酸组较莱菔硫烷组明显降低。
　　GSH-Px mRNA:盲肠结扎穿孔组在6h、12h较假手术组增高;莱菔硫烷组在各时间点较假手术组、盲肠结扎穿孔组增高;全反式维甲酸组表达水平在18h时间点较假手术组降低，在各时间点较盲肠结扎穿孔组降低，较莱菔硫烷组明显降低。
　　SOD mRNA:盲肠结扎穿孔组在6h、12h时间点均较假手术组增高，莱菔硫烷组在各时间点较假手术组与盲肠结扎穿孔组增高;全反式维甲酸组在12h、18h时时间点较假手术组降低，在各时间点较盲肠结扎穿孔组都有所下降，较莱菔硫烷组也有所降低。
　　结论:Nrf-2信号通路激活后能通过提高抗氧化酶如GSH-Px、SOD的表达，从而发挥抗炎、抗氧化效应，改善肝功能，对脓毒症急性肝损伤起保护作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词对照表

前言

材料与方法

一、实验对象、实验主要试剂、仪器及材料

(一)实验动物

(二)实验主要试剂

(三)主要仪器及耗材

二、实验方法

(一)实验动物分组

(二)大鼠脓毒症急性肝损伤模型的建立及干预

(三)实验动物观察、血清、肝脏标本采集及储存

(四)血清肝功能指标检测

(五)肝组织病理学检查

(六)肝组织匀浆炎症因子检测

(七)肝组织匀浆抗氧化酶检测

(八)Western Blot检测

(九)Rt-PCR检测

三、统计学处理

结果

一、大鼠建模及药物干预后表现

二、血清肝功能指标检测

(一)血清ALT水平检测结果

(二)血清AST水平检测结果

(三)血清总胆红素水平检测结果

三、肝组织病理学检查结果

(一)肝脏组织肉眼观

(二)病理HE染色镜下观

四、肝组织匀浆炎症因子检测结果

(二)肿瘤坏死因子-α检测结果

五、肝组织匀浆抗氧化酶检测结果

(一)SOD活力水平检测结果

(二)GSH-Px活力水平检测结果

六、Western Blot检测结果

七、Real-time PCR检测

(一)各组大鼠肝脏Nrf-2 mRNA表达情况

(三)各组大鼠肝脏GSH-Px mRNA表达情况

讨论

一、脓毒症急性肝损伤动物模型建立

二、脓毒症急性肝损伤的发病机制

三、Nrf-2信号通路对大鼠脓毒症急性肝损伤的保护作用

四、莱菔硫烷(SFN)对脓毒症急性肝损伤的影响

五、全反式维甲酸(ATRA)对脓毒症急性肝损伤的影响

小结

展望

参考文献

综述 Sepsis研究进展

致谢