海洋致病菌创伤弧菌的核酸适配体筛选，优化与初步应用

摘要

创伤弧菌（Vibrio vulnificus）是菌体短小，直杆状或弯曲弧状的革兰阴性弧菌属细菌，兼性厌氧，具有嗜盐性。创伤弧菌是常见的海洋致病菌，常常寄生于软体动物和贝壳动物，可通过进食染毒食物或伤口接触感染，病例多发生于临海的国家和地区。创伤弧菌感染致死率高，引发的死亡占弧菌感染致死人数的82％。创伤弧菌的感染发展迅速，最快接触后4小时即可出现症状，如果3天内没有得到抗生素治疗，死亡率可达100％。中国现行的创伤弧菌检测方法基于增菌培养，一般需要2-3天才能得到精确到种的结果。显然，基于培养的检测手段无法满足快速检测创伤弧菌的需求。因此发展一种快速、准确的新检测方法用于创伤弧菌的临床诊断和食品安全监控迫在眉睫。
　　近年来，研究者们开始尝试将核酸适配体应用于微生物检验检测领域。开发了许多基于核酸适配体的生物传感器平台，在分析诊断、食品安全等领域得到广泛应用。核酸适配体是单链的DNA或RNA，核苷酸单链构象的多态性意味着即使长度一致的核苷酸链也会具有不同的三级结构，因此适配体也被称为化学抗体。利用这一特性，通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术，将长度相同，序列随机排布的ssDNA或ssRNA文库与靶细菌孵育，不断富集、筛选和扩增与靶细菌结合的序列，即可筛选得到与靶标微生物特异性结合的核酸适配体。适配体可以批量合成，添加各种化学基团修饰，与阻抗生物传感器、流式细胞仪、胶体金检测仪等生物传感器联用，实现微生物的鉴别诊断。
　　本研究通过以菌体为靶标的SELEX技术筛选，获得两条与创伤弧菌特异性结合的核酸适配体，V8和V13。两条核酸适配体的亲和力均达到nM级别，去除引物区后，核酸适配体的随机区域依旧保持了它们的高特异性和高亲和力，在实际应用中更短的核苷酸序列也意味着更低的生产成本。核酸适配体可以与处于不同生长状态的创伤弧菌结合:对数生长早期、对数生长晚期、静止期和活的非可培养状态下的创伤弧菌与核酸适配体孵育后均显示了相似的荧光信号。激光共聚焦显微镜观察可以发现，与其他种属的细菌共同孵育，核酸适配体可以特异性地识别出创伤弧菌。此外，在处理过的血浆中和牡蛎浸出液中，V8依然能够保持构象稳定，与创伤弧菌结合不受影响。核酸适配体不仅可以检出创伤弧菌菌株ATCC27562，也可以检出其他来源分离得到的创伤弧菌菌株。
　　验证了流式细胞仪联合核酸适配体V8直接对液体样本进行创伤弧菌检测的可行性。该检测方法检测性能良好，理论检测限为:29.7CFU/mL，可靠检测限为100CFU/mL。线性范围为:500-500，000CFU/mL。用蛋白酶K作用创伤弧菌20min可得到细菌碎片，与核酸适配体V8结合后，荧光信号值比正常创伤弧菌高3倍，理论检测限降至7.804CFU/mL，可靠检测限为28CFU/mL。整个检测过程缩短至1h以内，与基于培养的检测方法相比显著降低。
　　综上，通过以菌体为靶标的SELEX技术，筛选到了特异性强，高亲和力的创伤弧菌核酸适配体。核酸适配体与流式细胞技术结合，不但大大降低了检测限，提高了检测速度，更是摆脱了以培养为基础的检测路线，使得活的非可培养状态下的创伤弧菌的检测更加便捷，准确。基于创伤弧菌核酸适配体的传感器可以提高临床检验检测和食品安全监控部门的工作效率，具有巨大的应用潜力。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

实验装置与材料

第一部分 创伤弧菌核酸适配体的筛选

一、实验方法

二、结果与讨论

三、小结

第二部分 创伤弧菌核酸适配体的鉴定与优化

一、实验方法

二、结果与讨论

三、小结

第三部分 创伤弧菌核酸适配体结合流式细胞仪检测的参数测定

一、实验方法

二、结果与讨论

三、小结

全文总结

参考文献

综述 常见致病性弧菌的鉴别检验

附录

致谢