多组学整合在肝癌恶性进展研究中的应用与相关分子机制探讨

摘要

第一部分:转录组和蛋白组整合分析鉴定乙醛脱氢酶2 ALDH2在肝癌恶性进展的作用及机制研究
　　研究背景和目的:
　　原发性肝癌是最常见的肝脏恶性肿瘤，也是中国最常见最致命的的恶性肿瘤之一，其发病率在恶性肿瘤中居第四位，而死亡率则位居肿瘤相关死亡的第三位，且是60岁以下男性中最常见和死亡率最高的肿瘤，居肝硬化病人相关死亡原因的首位。对于早期诊断的肝脏肿瘤病人，可以通过肝脏切除术、射频消融术、动脉化疗栓塞和肝移植，获得较好的治疗效果。但是大部分肝脏肿瘤病人初次确诊时即为晚期，由于大血管癌栓、包膜不完整、子灶和肿瘤多发等情况的存在，手术后仍然有相当高的复发率转移率，预后结果不理想，我国的肝癌诊疗形势依然相当严峻，早期诊断困难、复发转移率高、治疗手段少以及个性化治疗缺乏等仍然是肝癌诊疗工作中面临的主要问题。因此，急需探索新的诊疗方法，鉴定新的特异的肝癌进展分子标记，以建立更全面更有效的分子分型分层系统，并深入探讨肝癌切除术后复发转移相关的分子机制，这对于选择行之有效的治疗方式，减少肝癌切除术后复发转移，提高患者的生存质量，延长患者的生存期至关重要。
　　整合多个层次的组学数据，是全面而系统认识和研究肝细胞癌的一个重要方向。包括TCGA(The Cancer Genome Atlas)在内的多个国内和国际的研究项目为数据的整合提供了重要的资源，但是怎样整合多个组学的数据依然是困扰着肝癌研究的一个难题。其中，通过将多个组学的数据进行累加，寻找他们之间的共性，是目前使用的一种比较简单的数据整合方式。我们利用50例肝癌患者癌和癌旁的组织样本进行RNA测序（14例高转移样本，13例低转移样本），对高转移和低转移的混合样本进行蛋白质组测序，通过整合分析，寻找到了在肝癌发生和转移过程中表达变化频率比较高的酶，乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase-2，ALDH2）。
　　乙醛脱氢酶2 ALDH2，是醛脱氢酶的一种，负责催化乙醛氧化为乙酸的反应。在正常的生理状态下，肝中的乙醇脱氢酶负责将乙醇（酒的成分）氧化为乙醛，生成的乙醛作为底物进一步在乙醛脱氢酶2 ALDH2的催化下转变为无害的乙酸，进而分解成二氧化碳CO2和水H2O排出体外，从而使乙醛脱氢酶2 ALDH2扮演着重要的抗氧化应激分子角色，减少了乙醛的细胞毒性。以往的研究揭示，在病理状态下，由于乙醛脱氢酶2 ALDH2活性的降低或丧失，导致其催化乙醛的能力减弱，大量的乙醛在体内堆积引起了一系列的病理生理反应，造成饮酒后出现面部潮红、心跳加速等脸面潮红综合征现象，并可作为独立因素和饮酒与食管癌高风险密切相关。这一发现使脸面潮红综合征、饮酒和肿瘤的发病风险研究受到关注，但由于肿瘤的类型不同、患病人群各异，研究结果不尽一致。那么，在肝癌发展和转移复发过程中，乙醛脱氢酶2 ALDH2的表达情况如何，发挥着什么样的作用，以及如何发挥作用，尚未见报道。
　　研究方法:
　　1.收集相关临床肝癌患者样本，进行RNA和蛋白质组测序，经过生物信息学关联分析，筛选目标分子;
　　2.收集临床肝癌样本，经real-time PCR、Western blot、免疫组织化学技术检测乙醛脱氢酶2 ALDH2在肝癌组织中mRNA水平、蛋白水平的表达情况;
　　3.收集整理上述肝癌患者临床病理信息和随访预后资料，同时挖掘TCGA公用数据库，进行统计分析和预后分析，探讨ALDH2表达与临床病理特点的相关性，绘制receiving operating curve(ROC)曲线，计算area under curve(AUC)，评估乙醛脱氢酶2 ALDH2在肝癌病人中的临床诊断价值，以及对肝癌患者的总体生存和术后复发的预测价值;
　　4.利用慢病毒系统建立ALDH2过表达细胞系和siRNA介导的基因沉默技术调节ALDH2的表达，采用cell counting kit-8(CCK8)实验、划痕实验、transwell小室迁移实验、Matrigel穿膜侵袭实验观察高低表达ALDH2对肝癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的影响;同时利用酶活性检测技术、基因位点定点突变技术，检测对ALDH2酶活性、蛋白表达量以及对肝癌细胞迁移功能的影响;
　　5.利用裸鼠尾静脉注射肺转移模型及脾静脉注射肝转移模型，研究过表达ALDH2对肝癌细胞体内转移能力的影响;
　　6.利用real-time PCR、Western blot技术，结合表达谱芯片测序技术、质粒转染技术，研究ALDH2对AMPK等信号通路的影响;
　　7.利用Western blot技术，结合激活剂实验、抑制剂实验和siRNA介导的基因沉默技术调节ALDH2的表达，研究ALDH2与AMPK的关系及对其功能的影响;同时利用乙醛靶向检测技术研究ALDH2对乙醛催化的作用，利用外源性添加乙醛的方法探讨其对肝癌细胞迁移功能的影响。
　　研究结果:
　　1.RNA测序和蛋白质组测序整合分析提示，肝癌临床样本中乙醛脱氢酶2ALDH2在转录水平和蛋白水平均较癌旁组织显著降低;
　　2.在扩大肝癌临床样本中，乙醛脱氢酶2 ALDH2在转录水平和蛋白水平均显著低于癌旁组织，在转移能力较高的组织中表达水平更低;在检测的5种肝癌细胞系中，细胞系转移能力越强，乙醛脱氢酶2 ALDH2的蛋白表达水平越低;
　　3.在TCGA数据库和所检测的临床样本中，乙醛脱氢酶2 ALDH2低表达可以提示更具侵袭特点的临床病理特性和肝癌患者更差的预后，且具有一定的诊断价值;
　　4.体外实验提示，过表达乙醛脱氢酶2 ALDH2能够有效抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力;干扰乙醛脱氢酶2 ALDH2则能够明显提高肝癌细胞的迁移和侵袭能力;过表达乙醛脱氢酶2 ALDH2主要是通过提高ALDH2的酶活性而发挥作用;
　　5，体内实验提示，在尾静脉肺转移模型和脾静脉注射肝转移模型中，过表达乙醛脱氢酶2 ALDH2能够显著抑制肝癌细胞的体内转移能力;
　　6.过表达乙醛脱氢酶2 ALDH2可以活化AMPK相关的信号通路，与调控肝癌细胞的转移能力有关;
　　7.激活剂实验、抑制剂实验和siRNA介导的基因沉默技术调节AMPK表达实验提示，乙醛脱氢酶2 ALDH2通过活化AMPK相关信号通路而影响肝癌细胞的恶性进展，且与影响细胞内的氧化还原水平有关;同时过表达乙醛脱氢酶2 ALDH2可影响细胞内的乙醛水平而影响肝癌细胞的恶性进展。
　　结论:
　　本研究工作发现，在肝细胞癌中乙醛脱氢酶2 ALDH2表达水平在癌中较癌旁明显降低，在转移能力较高的肝癌组织中表达水平更低，通过大样本肝癌患者组织验证，我们发现这种低表达与肝癌的恶性临床病理指标具有明显的相关性，单因素和多因素分析进一步揭示乙醛脱氢酶2 ALDH2是独立的术后预后风险因素，且具有一定的临床诊断价值。体外和体内的实验进一步证明过表达乙醛脱氢酶2 ALDH2可以有效的抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力，并且这种能力主要是通过活化AMPK相关的信号通路实现的。我们首次报道了与肝癌恶性进展相关的乙醛脱氢酶2 ALDH2和AMPK信号通路的相互作用，这种相互作用可能是通过乙醛脱氢酶2 ALDH2影响细胞内的氧化还原水平实现的。综上所述，乙醛脱氢酶2 ALDH2在肝癌的恶性进展中起到了重要的作用，可能是肝细胞癌转移复发的诊断标志物和潜在的个性化临床治疗靶点，为临床探索新的肝癌治疗方案指明了一个新方向。
　　第二部分:转录组和基因组整合分析鉴定二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH在肝癌恶性进展的作用及机制研究
　　研究背景和目的:
　　肝细胞癌(primary liver cancer)是世界上第四位最常见的恶性肿瘤，近年来，随着影像诊断学、分子生物学等学科的不断进步，在肝癌的发病机理、诊断及治疗上，都取得了极大的进步，但是大多数患者在确诊时已经到了中晚期，失去了最佳的手术机会，常规放化疗不敏感，且术后经常出现复发转移，肝癌患者预后仍然相当差、病死率极高，严重威胁人类健康。在2015年，中国大约有47万新发现的肝癌病例，并有42万左右的病例死于肝癌。肝癌的诊疗形势仍然相当严峻，因此，阐明肝癌复发转移的分子机制，寻找行之有效的预后诊断标志物和干预靶点仍然是肝癌研究的重要方面，对提高肝癌的诊疗效果和预后具有关键意义。
　　代谢组学是继蛋白质组学和基因组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。蛋白质组学和基因组学分别从蛋白质和基因层面探寻生命的活动，而实际上细胞内许多生命活动是与代谢相关的，如细胞信号(cell signaling)，能量传递等都是受代谢调控的。有人认为，蛋白质组学和基因组学能够说明可能发生的事件，而代谢组学则反映确实已经发生了的事情。代谢组学的研究主要集中在已知代谢通路相关调节酶和基因，完成其在疾病发生发展等方面的研究。因此，为更全面的寻找新的代谢相关的诊断和预后标志物，我们通过对50例肝癌病人的癌和癌旁组织样本进行RNA测序（14例高转移样本，13例低转移样本），通过转录组和基因组生物信息学整合分析，鉴定了癌-癌旁样本，高转移-低转移样本中差异表达的基因，以及体细胞突变，和代谢通路相关酶的富集情况。在我们鉴定出的关键代谢酶中，发现二甲基甘氨酸脱氢酶(dimethylglycine dehydrogenase，DMGDH)具有良好的区分癌和癌旁的能力，是重要的诊断和预后相关因子。
　　本研究旨在深入探讨二甲基甘氨酸脱氢酶(DMGDH)在肝癌恶性进展过程中发挥的重要作用及可能的分子机制，为肝癌的精准治疗提供新的潜在靶点。
　　研究方法:
　　1.收集肝癌病人的癌和癌旁组织样本，进行RNA测序，经过生物信息学分析，包括体细胞突变、癌-癌旁组织差异基因、高转移-低转移组织差异基因等，筛选目标分子;
　　2.利用real-time PCR技术检测二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH在肝癌患者癌和癌旁样本转录水平的表达丰度;
　　3.利用Westem blot手段和免疫组织化学方法检测二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH在肝癌患者癌和癌旁组织中蛋白水平的表达情况;
　　4.绘制receiving operating curve(ROC)曲线，计算area under curve(AUC)，评估二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH在肝癌病人中的临床诊断价值;
　　5.收集整理上述肝癌病人临床相关病理信息和预后随访资料，同时挖掘TCGA数据库，统计分析二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH表达与临床病理特点的相关性，以及对肝癌病人的总体生存和术后复发的预测价值;
　　6.利用质粒过表达技术调节二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH的表达水平观察其对肝癌细胞增殖能力的影响;
　　7.利用质粒过表达技术以及siRNA介导的基因沉默技术调节二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH的表达水平，通过transwell小室迁移实验、Matrigel小室侵袭实验观察高低表达二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH对肝癌细胞迁移与侵袭能力的影响;
　　8.利用裸鼠尾静脉注射肺转移模型，研究过表达DMGDH对肝癌细胞体内转移能力的影响;
　　9.利用表达谱芯片测序技术、Western blot技术，结合细胞因子刺激实验，研究DMGDH对Akt信号通路的影响。
　　研究结果:
　　1.在肝癌临床样本中，二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH在转录水平及蛋白水平均显著低于癌旁组织，计算AUC提示具有临床诊断价值;
　　2.在所检测的RT-PCR样本、RNA测序样本以及TCGA数据库中，二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH低表达能够预测更具侵袭特点的临床病理特征和肝癌患者术后更高的复发率，具有一定的预后诊断价值;
　　3.过表达DMGDH并不显著影响肝癌细胞的增殖能力;
　　4.体外实验表明，过表达DMGDH能够明显抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力;干扰DMGDH则能够显著提高肝癌细胞的迁移和侵袭能力;
　　5.体内实验提示，在尾静脉肺转移模型中，过表达二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH能够有效抑制肝癌细胞的体内转移能力;
　　6.二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH可能通过抑制Akt相关信号通路而影响肝癌细胞的恶性进展。
　　结论:
　　本研究首先从临床肝癌病人的癌和癌旁组织样本入手，通过RNA测序技术，结合代谢相关转录组和基因组整合分析，筛选出二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH，并分析DMGDH在肝癌患者组织样本中的表达情况。我们发现DMGDH的表达在转录水平和蛋白水平都明显低于癌旁组织，在转移能力更高的癌栓组织中表达水平更低。临床相关性分析显示，组织中DMGDH的表达水平越低，癌栓发生率越高，甲胎蛋白AFP含量越高，且具有更高的肝癌术后复发率;随后通过质粒过表达及siRNA介导的基因沉默干扰技术，研究DMGDH对肝癌细胞生物学功能的影响;并进而阐明DMGDH调控肝癌细胞生物学功能可能的相关信号通路机制。我们的数据显示DMGDH主要是通过抑制Akt信号通路抑制肝癌细胞发生侵袭与转移，提示Akt信号通路在DMGDH抑制肝癌恶性生物学行为中可能具有重要作用。本研究旨在为深入理解DMGDH在肝癌恶性进展过程中的作用提供实验依据，并为肝癌的精准治疗提供一个新的潜在靶点。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 转录组和蛋白组整合分析鉴定乙醛脱氢酶2 ALDH2在肝癌恶性进展中的作用及机制研究

前言

材料方法

实验结果

讨论

第二部分 转录组和基因组整合分析鉴定二甲基甘氨酸脱氢酶DMGDH在肝癌恶性进展的作用及机制研究

前言

材料方法

实验结果

讨论

全文小结

参考文献

文献综述 疾病中的乙醛脱氢酶2：研究策略及研究进展

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢