长链非编码RNA-LINC01116在脑胶质瘤中的表达及其肿瘤生物学功能与机制的研究

摘要

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占全部颅内肿瘤的40％-65％，是颅内肿瘤患者的主要死因之一。其中低级别胶质瘤患者的预后往往较好，10年的总体生存率可以达到47％左右，而绝大多数高级别胶质瘤患者预后较差，其中多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)的恶性程度最高，其5年的存活率甚至小于3％，明确诊断后的平均生存时间只有12月左右。尽管医学界对胶质瘤患者的治疗已经做出了巨大的努力，但是对胶质瘤患者的预后改善仍然较差。造成胶质瘤治疗效果欠佳的原因不仅包括肿瘤本身增长迅速，血管密集，血运丰富，对放化疗的的耐受性，也包括肿瘤细胞向周围正常脑组织侵润的特性。胶质瘤的发生发展是一个非常复杂的生物学过程，其中涉及到了非常多的基因和细胞生物学行为的改变，为提高胶质瘤的治疗效果，新的治疗手段如基因靶向治疗开始兴起并应用于胶质瘤的治疗，然而目前临床上应用的药物，如替莫唑胺、贝伐单抗等，在患者中的有效率仍然很低。因此，只有全面深入地了解胶质瘤发生发展的分子机制，才能为临床对胶质瘤的诊治提供效率更高的分子靶向药物和更为精准的辅助诊断标志物。
　　随着基因测序、基因芯片和基因组学等研究技术的发展，越来越多的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)被发现参与到了中枢神经系统的病理生理过程中，在中枢神经系统的发展及疾病的发生过程中起到了重要的作用。长链非编码RNA的异常表达可能会导致一系列中枢系统疾病的发生，其对神经元细胞的分化影响巨大。并且长链非编码RNA在脑胶质瘤病理生理过程中的重要作用也越来越被广泛接受，其不仅可通过调控多种通路及与不同分子的相互作用来调控胶质瘤的发生发展，且在胶质瘤的转移和复发、分型和预后，及维持胶质瘤细胞干性上都发挥了重要的作用。
　　因此本研究通过lncRNAs芯片，表达谱芯片等高通量筛选技术，筛选出在胶质瘤发生发展过程中可能发挥重要作用的长链非编码RNA分子LINC01116，并结合生物信息学分析及一系列经典分子生物学技术等，在胶质瘤临床样本、体外胶质瘤细胞系、体内裸鼠荷瘤模型中对LINC01116分子在胶质瘤临床样本中的表达情况，以及其在胶质瘤发生发展过程中的所起到的具体的生物学功能及相关的分子机制进行全面而深入的研究。通过本课题的研究，我们期待明确LINC01116在胶质瘤发生发展过程中的功能与机制，并明确其在胶质瘤临床诊断和评估预后上的作用，为胶质瘤的诊断和预后提供新的标志物，并为其作为潜在药物作用靶点提供有力的实验依据。
　　第一部分:正常脑组织和脑胶质瘤肿瘤组织中长链非编码RNA与mRNA的芯片检测和分析
　　研究目的:观察在正常脑组织和胶质瘤肿瘤组织中差异表达的长链非编码RNA分子和信使RNA(messenger RNA，mRNA)分子的表达变化情况，挑选关键的长链非编码RNA分子作为进行深入研究的对象。
　　研究方法:收集2014年12月至2015年5月间在上海长征医院神经外科收治并手术切除的5例胶质母细胞瘤临床组织样本和5例正常脑组织样本，使用Arraystar人类LncRNA芯片V3.0芯片系统地检测长链非编码RNA和信使RNA的表达，筛选差异倍数≥2的长链非编码RNA和信使RNA，并应用配对t检验计算长链非编码RNA和信使RNA在两组间差异的显著性，p≤0.05时差异具有统计学意义，最终取差异倍数≥2，且p≤0.05的长链非编码RNA和信使RNA，并随机挑选12个分子采用实时定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)在原5对正常脑组织和胶质母细胞瘤样本验证芯片数据的可靠性。利用生物信息学靶定与胶质瘤发生发展密切相关的长链非编码RNA分子。
　　结果:共有4502条lncRNA和5492条mRNA在两组样品间表达差异明显。其中2601条lncRNA和2693条mRNA表达上调，1901条lncRNA和2799条mRNA表达下调。qRT-PCR的结果提示挑选出的12个分子的表达与lncRNA和mRNA芯片结果的表达趋势一致。其中长链非编码LINC01116在肿瘤组织中显著上调表达，提示它可能对胶质瘤的发生发展具有重要作用。
　　结论:(1)通过基因芯片检测发现，对比正常脑组织，在脑胶质瘤组织中存在大量差异表达的长链非编码RNA和信使RNA，这些差异表达的分子可能与胶质瘤的发生发展和迁移侵袭过程密切相关，为后续进一步筛选与胶质瘤发生发展相关的关键长链非编码RNA提供了基础。(2) qRT-PCR验证了基因芯片的结果，证明lncRNA和mRNA芯片结果是可靠的。(3)生物信息学分析靶定了可能在胶质瘤发生发展过程中发挥关键作用候选长链非编码RNA分子LINC01116。
　　第二部分:长链非编码RNA-LINC01116在人脑胶质瘤临床样本中的表达情况及临床意义
　　研究目的:扩大临床样本验证LINC01116分子在不同级别胶质瘤中的表达情况，分析其与胶质瘤患者的临床病理指标及生存预后是否存在关联，并为其是否能作为胶质瘤诊断和治疗的靶点及评估胶质瘤患者预后的指标提供有力的实验依据。
　　研究方法:收集2004年1月至2015年12月间上海长征医院收治并手术的89例不同级别的脑胶质瘤患者的临床样本与临床资料及13例正常脑组织样本，通过qRT-PCR检测LINC01116分子在个样本中的表达。采用独立样本t检验、单因素分析、多因素分析、卡方检验、相关性分析及生存分析等统计学方法分析其与脑胶质瘤患者临床病理指标及生存预后的相关性。
　　结果:对比正常脑组织，qRT-PCR结果提示LINC01116在脑胶质瘤样本中呈显著上调表达，其在高级别胶质瘤中的表达明显高于低级别(P＜0.001)。通过将LINC01116在本组胶质瘤临床样本中的表达与本组脑胶质瘤患者的生存与预后进行统计分析我们发现:LINC01116的表达与本组胶质瘤患者的完全无进展生存期（progression free survival，PFS）及总体生存期(overall survival，OS)均存在显著的统计学关系(P=0.043，P=0.008)，LINC01116表达量低的患者，其复发和总体生存情况均较好。
　　结论:长链非编码RNA分子LINC01116在脑胶质瘤组织中呈显著高表达，且其与脑胶质瘤患者的临床病理级别及生存预后情况密切相关，具备成为脑胶质瘤辅助性诊断分子标志物和评估脑胶质瘤患者生存预后指标的潜能。
　　第三部分:长链非编码RNA-LINC01116在脑胶质瘤发生发展过程中的生物学功能与分子机制研究
　　研究目的:明确长链非编码RNA分子LINC01116在胶质瘤发生发展过程中的生物学功能;初步探索LINC01116分子发挥生物学功能的分子机制及其下游可能的调控靶点，以期为胶质瘤的分子诊断和临床治疗提供新的药物作用靶点和思路，并提供相应的理论和有力的实验依据。
　　研究方法:通过在胶质瘤细胞系U251、U87MG、A172、U118MG中利用慢病毒载体构建稳定表达的干扰或过表达LINC01116分子的胶质瘤细胞系，并在体外细胞实验中利用流式细胞技术检测细胞周期、CCK8实验检测细胞的增殖能力、transwell小室实验检测细胞的迁移侵袭能力，及小管形成实验检测LINC01116分子对HUVEC细胞小管形成能力的影响，在U87MG细胞系中构建干扰LINC01116分子的稳转细胞系进行裸鼠皮下荷瘤检测LINC01116分子在体内实验中对肿瘤形成的影响。通过在干扰LINC01116分子的U251稳转细胞系中构建表达谱基因芯片，结合qRT-PCR、Western bolt、双荧光素酶报告系统等实验技术靶定LINC01116分子的下游靶基因及相关信号通路。
　　结果:通过实验我们发现干扰LINC01116的表达后，在体外细胞水平提示:胶质瘤细胞生长周期阻滞在G1期，肿瘤细胞生长减慢，增殖能力下降，同时肿瘤细胞的迁移和侵袭能力显著下降。在体内裸鼠皮下荷瘤提示:干扰LINC01116分子的表达后，裸鼠皮下成瘤能力显著下降，对生成的肿瘤进行血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factA，VEGFA)、CD31等分子的免疫组化发现，VEGFA、CD31的表达显著下降，肿瘤内部血管生成能力显著下降。通过分析表达谱芯片结果并结合生物信息学分析，我们发现VEGFA为LINC01116分子的下游靶基因，且LINC01116分子与VEGFA分子的3'UTR区均存在miR-31-5p的结合位点，双荧光素酶报告实验提示LINC01116与VEGFA分子的3'UTR区均可吸附miR-31-5p分子。Western bolt提示干扰LINC01116后VEGFA的蛋白表达下降。
　　结论:长链非编码RNA-LINC01116可以通过调控胶质瘤细胞的生长周期进而调控胶质瘤细胞的增殖能力，且其在维持胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力方面发挥着重要作用; LINC01116可通过竞争性吸附miR-31-5p在转录后水平调节VEGFA分子的表达，从而影响胶质瘤血管的生成，进而影响肿瘤的生成。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 正常脑组织和脑胶质瘤肿瘤组织中长链非编码RNA与mRNA的芯片检测和分析

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

参考文献

第二部分 长链非编码RNA-LINC01116在人脑胶质瘤临床样本中的表达情况及临床意义

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

参考文献

第三部分 长链非编码RNA-LINC01116在脑胶质瘤发生发展过程中的生物学功能与分子机制研究

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

参考文献

第四部分 总结

附录

文献综述 长链非编码RNA在脑胶质瘤发生发展和I临床诊治中的研究进展

发表论文和参加科研工作情况说明

致谢