硫化氢在芥子气致肺氧化应激损伤中的作用及机制研究

摘要

芥子气（sulfur mustard，SM）是糜烂性毒剂的典型代表，多次在各种冲突中使用，造成重大伤亡，也一直是我军面临的化学战剂威胁之一。芥子气结构简单，难防难治，易于合成，容易被恐怖分子掌握和利用，是最有可能被用于恐怖袭击的毒剂之一，也是中国面临的化学恐怖威胁之一。因此，积极探索芥子气中毒机制，开发有效的防治药物，对我军战斗力的保持、国家公共安全和中国公民健康都具有重大的战略意义。
　　肺是芥子气损伤的主要靶器官，急性肺损伤是芥子气致死的主要原因之一，而氧化应激是芥子气肺损伤的起始和关键环节之一。硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)作为一种新型气体信号分子，广泛参与机体的多种生理和病理过程，具有明确的抗氧化作用。H2S可以通过抑制ROS的产生，促进GSH合成，促进Nrf2核转位等途径改善肺纤维化，肺缺血再灌注损伤和急性肺损伤。H2S对于肺部正常生理功能的维持具有重要的作用。
　　本文研究发现，H2S在动物和细胞水平上都参与了芥子气致肺损伤的调节过程，可改善芥子气引起的肺氧化应激损伤;进一步研究发现，H2S可通过硫巯基化Keap1使Nrf2解离，促进Nrf2入核表达，在芥子气致肺损伤中发挥抗氧化应激调节作用。
　　一、H2S对芥子气染毒小鼠肺部损伤的作用及机制研究
　　芥子气染毒后，采用比率计H2S荧光探针RHP-2检测不同时间点肺组织中H2S的含量变化，结果发现，染毒后第1天开始肺组织中H2S含量开始下降，第3天与对照组有明显差异(P＜0.01）。蛋白印迹法检测肺组织中H2S合成酶CBS和CSE的表达，芥子气染毒后第1天到第4天，小鼠肺组织中CBS没有明显变化，而CSE表达降低，第3天与对照组相比有明显差异(P＜0.01）。
　　进一步考察了内源性H2S含量变化与芥子气致小鼠肺损伤的关系，芥子气染毒小鼠给予H2S供体化合物NaHS后可升高内源性H2S含量，给予H2S合成酶抑制剂PPG则可降低内源性H2S含量。通过染毒后第3天小鼠肺组织HE染色的病理切片发现，芥子气染毒小鼠肺组织中肺泡壁增厚，间质及肺泡腔出血，炎性细胞浸润;NaHS可以改善芥子气造成的肺损伤，PPG则会加重损伤。另外，NaHS可以降低肺湿/干重比和肺泡灌洗液中的蛋白浓度，显著改善肺损伤。
　　也对小鼠肺组织氧化应激损伤情况做了分析。芥子气染毒后，SM组小鼠肺组织中的H2O2、MDA含量显著升高;与SM相比，SM+NaHS组H2O2、MDA含量显著降低，SM+PPG组H2O2、MDA含量显著升高。同时，SM组小鼠肺组织中的GSH/GSSG、SOD活性显著降低，SM+NaHS组与SM相比，GSH/GSSG、SOD活性显著升高;SM+PPG组GSH/GSSG、SOD活性显著降低。
　　进一步考查了Keap1-Nrf2通路上的Nrf2、HO-1和NQO1等相关蛋白表达和下游GR、GCLC和GCLM等相关基因表达，初步探讨了H2S在芥子气致小鼠肺损伤中发挥作用的可能机制。结果显示，染毒小鼠给予NaHS可促进Nrf2入核表达，升高Nrf2下游相关抗氧化基因HO-1、NQO1、GCLC、GR、GCLM和抗氧化蛋白HO-1、NQO1表达，从而减轻氧化应激损伤;给予PPG会出现相反的结果。这提示Nrf2可能在H2S调节SM致肺损伤的过程发挥重要作用。
　　二、H2S对芥子气染毒BEAS-2B细胞和MRC-5细胞的保护作用及机制研究
　　进一步在细胞水平上验证了H2S对芥子气损伤的保护作用和机制。应用CCK-8法检测不同浓度芥子气对人支气管上皮细胞BEAS-2B和人肺成纤维细胞MRC-5毒性作用，给予不同浓度的NaHS，结果显示当NaHS浓度为70μM时可显著升高芥子气染毒细胞活力。通过NIR-HS荧光探针孵育细胞后共聚焦显微镜下观察荧光强度，进一步研究内源性H2S含量变化，同时检测细胞内ROS分析氧化应激损伤状态，观察发现，给予NaHS组与芥子气组相比，细胞荧光强度即内源性H2S含量升高，细胞内ROS含量明显降低。应用基因沉默技术，敲低CSE表达后的细胞荧光强度即内源性H2S含量低于普通细胞，细胞内ROS含量升高。敲低CSE后给予NaHS的细胞内NaHS升高H2S含量的作用被阻断，且细胞内ROS含量明显升高。结果表明，NaHS可通过CSE升高内源性H2S含量，并改善细胞内氧化应激损伤。
　　细胞水平上研究Nrf2在H2S调节SM致损伤中的作用。普通细胞中，与SM处理组相比，SM+NaHS组胞核中Nrf2表达显著升高，Nrf2下游的HO-1和NQO1表达明显升高，细胞内ROS含量降低。质粒转染沉默Nrf2基因表达细胞中，SM+NaHS组与普通细胞中的SM+NaHS组相比，胞浆和胞核中的Nrf2表达均显著降低，Nrf2下游的HO-1和NQO1表达显著降低，细胞内ROS含量升高。结果表明，基因沉默Nrf2后，与普通细胞中的SM+NaHS组相比，NaHS在芥子气染毒细胞中的作用被阻断。进一步检测细胞中S-硫巯基化Keap1蛋白表达，发现SM组同对照组相比，S-硫巯基化Keap1蛋白表达降低;SM+NaHS组与SM组相比，S-硫巯基化Keap1蛋白表达显著升高，细胞中应用硫巯基化抑制剂DTT后，SM+NaHS+DTT组与SM+NaHS组相比，S-硫巯基化Keap1蛋白表达显著降低，且胞核中Nrf2表达降低。结果表明，芥子气损伤细胞中硫巯基化抑制剂DTT可以阻断NaHS的保护作用，H2S通过硫巯基化Keap1促进Nrf2核转录，在芥子气损伤中发挥抗氧化应激作用。
　　本实验研究中发现，芥子气致肺氧化应激损伤中内源性H2S含量降低，通过给予芥子气染毒小鼠H2S供体化合物NaHS，可升高内源性H2S含量，促进Nrf2入核表达，升高Nrf2下游相关抗氧化基因HO-1、NQO1、GCLC、GR、GCLM和抗氧化蛋白HO-1、NQO1表达，改善芥子气造成的肺氧化应激损伤。细胞实验中研究发现NaHS可通过H2S合成酶CSE升高芥子气损伤细胞中内源性H2S含量，进一步通过硫巯基化Keap1促进Nrf2核转录，改善芥子气损伤细胞内氧化应激水平。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 H2S对芥子气染毒小鼠肺部损伤的作用及机制研究

二、材料和方法

三、实验结果

第二章 H2S对芥子气染毒BEAS-2B细胞和MRC-5细胞的保护作用及机制研究

二、材料和方法

三、实验结果

讨论

参考文献

文献综述 气体信号分子硫化氢抗氧化应激损伤的研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢