骨桥蛋白在介导黄韧带骨化过程中的作用机制研究

摘要

研究目的：
　　黄韧带骨化病会导致严重的脊髓神经损伤，因其缺乏有效的药物及其它保守治疗手段，手术是唯一的有效治疗方法，但手术后脊髓神经恢复程度有限。前期研究发现黄韧带骨化组织中骨桥蛋白及其受体的表达，能诱导体外黄韧带骨化细胞的骨化指标表达增加，并能诱导黄韧带骨化动物模型，说明骨桥蛋白在黄韧带骨化中起着重要作用。但骨桥蛋白在黄韧带骨化过程中的具体作用机制尚不清楚，本研究旨在从分子通路方面进一步阐明骨桥蛋白在黄韧带骨化发生过程中的作用机制。
　　研究方法：
　　通过组织学以及分子生物学的相关研究手段明确骨桥蛋白在诱导黄韧带骨化发病过程中的作用机制，并通过动物模型进行验证，从而明确OPN在诱导人黄韧带细胞骨向分化中的作用。
　　2.1 人OLF骨化组织和未骨化的黄韧带中的OPN和OPN受体的表达。
　　分组:将黄韧带骨化标本分成两个组，分别为黄韧带骨化组以及非黄韧带骨化组，两组各8例。
　　免疫组织化学:将手术中取的黄韧带骨化标本经过多聚甲醛固定，并组织脱钙，石蜡包埋后切片后进行OPN、CD44以及Integrin的免疫组织化学染色，封片观察染色结果。
　　2.2 黄韧带细胞分离、培养及OPN的骨化诱导。
　　分离与培养:利用组织块贴壁法分离人的黄韧带细胞，分离后的组织块继续贴壁使用，分离出来的细胞倒置显微镜观察其生长形态，长到汇合后传代，多的细胞液氮冻存备用。
　　诱导:将体外培养的第三代黄韧带细胞种到六孔板中，培养24h后用浓度为100ng/ml的OPN进行干预48h，WB检测骨化指标ALP以及OCN在干预前后的表达变化。
　　2.3 骨桥蛋白诱导黄韧带骨化的分子通路的检测与确定
　　MAPK信号通路磷酸化检测:将体外培养的第三代黄韧带细胞种于六孔板中，用浓度为100ng/ml的OPN进行干预，分别在0min、15min、30min、60min、120min时间点终止干预，WB检测MAPK信号通路分子ERK1/2、P38、JNK在时间梯度上的磷酸化情况。
　　信号通路阻滞:分别用ERK1/2、P38特异的抑制剂U0126、SB203580抑制ERK1/2和P38信号分子的磷酸化24h后，WB检测在OPN诱导黄韧带细胞48h后的骨化指标ALP以及OCN的表达变化。
　　2.4 SB203580抑制P38信号分子对OPN诱导OLF动物模型的影响
　　动物模型的处理:在4℃下分别将OPN组:OPN-matrigel、P38阻滞组:OPN-SB203580-matrigel和ERK阻滞组:OPN-U0126-matrigel，经椎板间隙注入到黄韧带。术后12周Micro-CT检查各组黄韧带骨化情况。
　　研究结果：
　　3.1 OLF黄韧带和骨化组织中的OPN和OPN受体的表达
　　在所有8例黄韧带骨化组织中的软骨细胞周围可见OPN和CD44表达阳性，而Integrin表达阴性;而OPN、CD44和Integrin在未骨化的黄韧带细胞周围表达均阳性，而且在黄韧带内血管内皮细胞周围也均成阳性表达。
　　3.2 黄韧带细胞分离、培养及诱导
　　组织块贴壁分离出的黄韧带细胞大小形状不一，细胞基质透亮，细胞形态以梭形以及纺锤形为主，同时也有部分细胞形态呈五角形和椭圆形。原代黄韧带细胞自胸椎黄韧带组织块爬出的早期呈散在性分布，随后进展逐渐生长密集，并以黄韧带组织块为中心，细胞向外周呈辐射状生长，在和其他黄韧带组织块中的原代细胞交会时，则会发展为涡旋状生长。黄韧带骨化组细胞中呈五角形和椭圆形的细胞比非黄韧带骨化组多，并在显微镜视野中可见多个散在细胞结节分布。WB检测骨化组的黄韧带细胞较正常组细胞OPN表达水平增加。OPN干预OLF-LFC，WB检测可见骨化指标ALP、OCN的表达增加。
　　3.3 骨桥蛋白诱导黄韧带骨化的分子通路的检测与确立
　　在0min、15min、30min、60min、120min不同时间点，随着OPN干预时间的增加通过WB检测的ERK1/2以及P38信号分子的磷酸化水平也逐渐增加，但JNK的磷酸化水平随时间的延长变化不明显。在P38的抑制剂SB203580的作用下，OPN诱导的骨化组黄韧带细胞的骨化指标ALP以及OCN的表达水平较未阻滞组显著下调，且跟空白组的表达水平接近。但在ERK1/2的抑制剂U0126作用下则对OPN诱导的骨化作用抑制不明显。
　　3.4 SB203580阻断P38通路对OPN诱导OLF动物模型的影响
　　术后12周Micro-CT检查见OPN组和ERK阻滞组均可见黄韧带区可见高密度影，而P38阻滞组未见黄韧带区高密度表现。
　　研究结论：
　　4.1 黄韧带骨化区域中表达OPN及其受体CD44，但未发现其受体integrin的表达，而在未骨化区中特别是在血管内皮细胞周围表达OPN、CD44以及integrin。
　　4.2 通过体外组织块贴壁法能有效的培养出黄韧带细胞，OPN能诱导体外培养的骨化组黄韧带细胞表达ALP等成骨指标表达增加。
　　4.3 OPN能激活MAPK信号通路中的ERK1/2以及P38信号分子的磷酸化，而JNK信号分子的磷酸化激活并不确切。抑制ERK1/2信号分子的磷酸化不能有效阻断OPN诱导的黄韧带细胞骨化，而抑制P38信号分子的磷酸化可以有效的阻断OPN诱导的黄韧带细胞骨化。
　　4.4 抑制P38信号通路分子能有效抑制OPN诱导的家兔黄韧带骨化模型的骨化进程。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、研究背景

二、课题总体设计

第一部分：OLF黄韧带和骨化组织中的OPN和OPN受体的表达

1．材料

1．方法

2 结果

2．讨论

3．结论

第二部分：黄韧带细胞的分离、培养及诱导

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

4．结论

第三部分 MAPK信号通路的激活与阻断

1．材料

2．方法

3．结果

2．讨论

结论

第四部分 SB203580阻断P38通路对OPN诱导OLF动物模型的影响

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

全文小结

综述 骨桥蛋白及其功能相关的研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢