白藜芦醇在体外及体内对皮肤鳞状细胞癌的抗肿瘤效应及机制研究

摘要

目的：
　　皮肤鳞状上皮细胞癌(Squamous cell carcinoma，SCC)是一种在中国高发的皮肤系统恶性肿瘤，一经确诊其首选治疗策略是手术切除，但因为它在患者身上发展缓慢、常无自觉症状，容易被忽视和发现不及时，导致增加疾病风险的同时，增大手术创面，影响患者美观。此外，SCC具有侵袭生长与转移等特性，若发现较晚，需结合辅助的化疗和放射治疗。但是长期的放疗与化疗会使患者产生各种相关并发症，同时化疗药物的使用也会使肿瘤细胞产生耐药性。因此，近几年来，研究者们致力于发现日常饮食中高效低毒的天然产物的抗癌潜力，希望预防皮肤鳞状上皮癌的发生和降低化放疗药物的使用。
　　白藜芦醇(Resveratrol，RES)属于具有广泛的药理学作用的多酚类天然产物，其药理作用包括抗肿瘤、抗病毒、预防阿奇霉素引发的心脏毒性、预防心脑血管疾病、抗帕金森病等。同时，基于细胞系与实验动物的体内外肿瘤模型研究和基于不同人群的临床试验均发现白藜芦醇及其低聚物也是实体肿瘤与血液系统肿瘤的有效化学预防剂。虽然白藜芦醇被证明具有广谱的抗肿瘤作用，然而缺乏对白藜芦醇在皮肤肿瘤中的系统研究，尤其是基于动物模型的体内研究。因此，本研究首先在体外水平上利用两种SCC代表细胞系详尽研究白藜芦醇抗肿瘤效应的浓度梯度与时间梯度的关系，并初步探索其抗肿瘤效用的细胞机制和分子机制;然后构建皮肤SCC的化学诱导大鼠模型，在体内水平进一步验证白藜芦醇对SCC的抗肿瘤作用及其作用机理。
　　论文将在白藜芦醇抗SCC的体内外系统研究中，探索其药理活性与作用剂量和作用时间的依赖性，并揭示白藜芦醇发挥抗SCC效应与周期及凋亡调节的关系，以期为白藜芦醇在SCC的预防与治疗研发中提供新的方向，为白藜芦醇在SCC预防与治疗的剂量选择上提供切实的数据基础。
　　方法：
　　1、基于鳞状细胞癌细胞系的白藜芦醇体外抗肿瘤活性研究
　　Ⅰ:在SCC细胞系SCC1与Colo-16中，采用CCK-8法探索白藜芦醇抑制肿瘤细胞增殖活力的浓度依赖性与时间依赖性;
　　Ⅱ:在对白藜芦醇给药更加敏感的细胞系SCC1中，采用Annexin-Ⅴ/PI双染联合流式细胞术的方式考察白藜芦醇是否具有诱导SCC细胞凋亡的能力;
　　Ⅲ:在SCC细胞系中，通过Western blotting、半定量PCR与实时荧光定量PCR考察白藜芦醇对细胞凋亡与细胞周期通路关键基因mRNA与表达水平的影响，初步探索白藜芦醇发挥体外细胞杀伤活性的信号传导途径。
　　2、基于DMBA/TPA刺激的大鼠皮肤SCC模型的白藜芦醇体内抗肿瘤活性研究
　　Ⅰ:本研究中的大鼠皮肤SCC模型使用经典的二阶段DMBA/TPA化学诱导方法建立。将Wistar实验大鼠分为四组:丙酮空白对照组(Control)、化学诱导模型组(DMBA)、低剂量白藜芦醇处理组（DMBA+RES-1）与高剂量白藜芦醇处理组（DMBA+RES-2）。通过测量四组大鼠体重、肿瘤发生率、肿瘤抑制率、肿瘤体积与肿瘤重量等指标考察两个剂量的白藜芦醇的体内抗肿瘤活性;
　　Ⅱ:通过流式细胞术周期分布分析、Ki-67免疫组化增殖染色、Annexin-Ⅴ/PI双染联合流式细胞术凋亡分析以及TUNEL凋亡组织化学染色共同考察白藜芦醇在SCC动物模型中是否具有周期阻滞与凋亡诱导的作用;
　　Ⅲ:最后在该SCC动物模型中通过Western blotting检测白藜芦醇对细胞周期与凋亡通路关键基因的调节作用。与其在体外的信号通路调节作用相对应，在体内验证白藜芦醇抗SCC的信号传导通路，为白藜芦醇抗SCC分子机制的深入探索提供方向。
　　结果：
　　1、基于鳞状细胞癌细胞系的白藜芦醇体外抗肿瘤活性研究
　　Ⅰ:白藜芦醇对SCC1细胞可以发挥明显的细胞毒作用。31.25μM的白藜芦醇孵育72h可以将SCC1的细胞活力抑制到20％。白藜芦醇在7.81μM-31.25μM的中等浓度范围内，其细胞活力抑制效果与作用浓度和作用时间呈明显正相关;而只有高浓度的白藜芦醇才对Colo-16具有较弱的抑制活性，仅能将Colo-16的细胞活力抑制到80％;
　　Ⅱ:白藜芦醇能显著的促进SCC1细胞的凋亡，且具有明显的浓度依赖性;
　　Ⅲ:白藜芦醇能显著的且不具浓度依赖性的上调SCC1细胞凋亡通路基因p53、p21、Bax与caspase-3的mRNA水平与蛋白水平，同时还能抑制SCC1细胞G2/M周期检查点基因cyclin B与cdc2的转录与表达水平。
　　2、基于DMBA/TPA刺激的大鼠皮肤SCC模型的白藜芦醇体内抗肿瘤活性研究
　　Ⅰ:与对照组相比，模型组大鼠均产生肉眼可见的肿瘤团块，且该团块中有明显角化异常细胞，说明DMBA/TPA诱导的二阶段皮肤SCC模型成功;
　　Ⅱ:DMBA组荷瘤大鼠体重在实验周期内几乎持平没有增长，而Control组体重则是按照正常趋势增长。而与模型组相比，白藜芦醇处理组的荷瘤大鼠体重则保持增长，尤其是高剂量白藜芦醇处理组大鼠的体重增长趋势与对照组类似。同时，两个剂量的白藜芦醇均能减少肿瘤发生率、肿瘤体积与肿瘤重量;并且高剂量白藜芦醇处理组比低剂量组表现出更良好的肿瘤生长抑制效果;
　　Ⅲ:与DMBA组相比，高剂量与低剂量白藜芦醇处理组细胞处于G1期的比例减少而处于G2/M期的比例明显增多;处于早期凋亡与晚期凋亡期的比例也显著升高，同时Ki-67阳性处于增殖周期的细胞比例减少，说明在DMBA/TPA刺激的皮肤SCC模型中白藜芦醇同时具有G2/M期阻滞与凋亡诱导的作用;
　　Ⅳ:与Control相比，两个白藜芦醇处理组DMBA+RES-1与DMBA+RES-2的凋亡基因p53、p21、Bax与caspase-3表达被上调，凋亡抑制基因survivin表达被下调，G2/M细胞周期检查点基因cyclin B与cdc2表达被下调，说明白藜芦醇具有周期阻滞与凋亡诱导的体内活性。
　　结论：
　　1、基于鳞状细胞癌细胞系的白藜芦醇体外抗肿瘤活性研究
　　Ⅰ:对比白藜芦醇对SCC1与Colo-16细胞系的细胞毒作用浓度与时间趋势图，发现白藜芦醇的细胞杀伤作用具有明显的选择性。白藜芦醇对Colo-16仅在高浓度表现出较弱的细胞抑制活性，也没有明显的浓度依赖性;而在7.81μM-31.25μM范围内的白藜芦醇对SCC1的细胞毒作用具有明显的时间梯度与浓度梯度依赖性;
　　Ⅱ:白藜芦醇可以浓度依赖的诱导SCC1细胞进入凋亡程序，其对SCC1细胞展现出来的细胞毒作用可能依赖于诱导细胞凋亡;
　　Ⅲ:白藜芦醇可能通过调控p53-p21-Bax-caspase-9途径的转录与表达水平诱导细胞凋亡发挥其细胞毒活性;另一方面，白藜芦醇也可以调节周期检查点中心调控蛋白cyclin B与cdc2的mRNA与蛋白水平，然而在该细胞系中白藜芦醇并没有对细胞周期分布产生影响，可能还有除G2/M期检查点之外的途径共同参与对细胞的周期调控。
　　2、基于DMBA/TPA刺激的大鼠皮肤SCC模型的白藜芦醇体内抗肿瘤活性研究
　　Ⅰ:低剂量(1mg/kg/qw)与高剂量(2mg/kg/qw)白藜芦醇处理均能够有效恢复荷瘤大鼠体重增长趋势;综合白藜芦醇对荷瘤大鼠体重、肿瘤发生率、肿瘤抑制率、肿瘤体积与肿瘤重量的影响，两个剂量的白藜芦醇均具有SCC肿瘤抑制作用，并且高剂量的白藜芦醇比低剂量抑制效果更加显著;
　　Ⅱ:白藜芦醇可能通过抑制肿瘤细胞增殖、将肿瘤细胞周期阻滞在G2/M期及促进肿瘤细胞凋亡发挥上述抗肿瘤作用;
　　Ⅲ:白藜芦醇可能通过p53-p21-Bax-caspase-9途径与survivin依赖的方式诱导细胞凋亡，并通过p53-cyclin B/cdc2途径将细胞周期阻滞在G2/M期。
　　白藜芦醇具有良好的体内外抗SCC活性，进一步探索其体内剂量范围、作用机制乃至联合用药策略将会加速白藜芦醇在预防与治疗SCC中的应用。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 白藜芦醇对SCC细胞系的药理效用检测及作用机制探讨

(一)SCC的现状

(二)SCC的重要形成因素

(三)白藜芦醇的研究现状

(四)白藜芦醇与SCC

二、材料与方法

(一)技术路线图

(二)主要试剂和仪器

(三)实验方法

三、实验结果

(一)白藜芦醇对SCC1细胞活力影响的时间梯度与浓度梯度关系

(二)白藜芦醇对Colo-16细胞活力影响的处理时间与浓度梯度关系

(三)白藜芦醇对SCC1细胞系凋亡水平的影响

(四)白藜芦醇对SCC1细胞凋亡与周期通路基因表达水平的影响

(五)白藜芦醇对SCC1细胞凋亡与周期通路基因mRNA水平的影响

四、讨论与小结

参考文献

第二部分 白藜芦醇在大鼠皮肤鳞状细胞癌模型中的抗肿瘤作用及其机制的研究

一、前言

二、材料与方法

(一)技术路线图

(二)实验动物

(三)主要试剂和仪器

(四)实验方法

三、实验结果

(一)对照组与模型组表皮肿瘤发生的观察与病理染色对比

(二)白藜芦醇对荷瘤大鼠体重的影响

(三)白藜芦醇对荷瘤大鼠肿瘤发生率的影响

(四)白藜芦醇在DMBA／TPA诱发SCC大鼠模型中的肿瘤抑制率统计

(五)白藜芦醇对DMBA／TPA诱发SCC大鼠肿瘤结节体积的影响

(六)白藜芦醇DMBA／TPA诱发SCC大鼠肿瘤结节重量的影响

(七)白藜芦醇对DMBA／TPA诱发SCC上皮细胞的周期调控影响

(八)白藜芦醇对DMBA／TPA诱发SCC细胞的增殖抗原表达的影响

(九)白藜芦醇对DMBA／TPA诱发SCC细胞的凋亡刺激作用检测

(十)白藜芦醇对DMBA／TPA诱发SCC细胞的周期调控与凋亡通路关键基因表达影响的检测

四、小结与讨论

参考文献

全文总结

综述 白藜芦醇的抗肿瘤效应、机制及其应用进展

在读期间发表论文与科研工作情况说明

致谢