大鼠肝硬化门脉高压模型中门脉压力相关参数分析及卡维地洛降门脉压力疗效机制初探

摘要

目的： 慢性肝病是全球范围内重大公共卫生问题之一.各种慢性肝病进展至肝硬化后常常发生门脉高压(Portal hypertension,PH),而门脉高压可进一步导致腹水、脾功能亢进、食管-胃底静脉曲张、肝性脑病等一系列并发症的发生,严重影响肝硬化患者预后. 卡维地洛作为非选择性β受体阻滞剂,同时具有α1受体阻滞活性.已有临床试验证明,卡维地洛降低肝硬化患者HVPG效果优于普纳洛尔,但鲜有动物实验验证卡维地洛改善门脉高压作用并明确其降门脉压力具体机制. 本研究通过建立大鼠肝硬化门脉高压模型,观察门脉压力及相关参数并分析两者之间相关性,为临床建立门脉压力评估模型、无创诊断门脉高压提供依据;运用建立的大鼠肝硬化门脉高压模型验证卡维地洛改善门脉高压疗效,并初步探讨卡维地洛治疗大鼠门脉高压机制,为后续门脉高压相关研究奠定基础. 方法： 一、大鼠肝硬化门脉高压模型制备 1.硫代乙酰胺大鼠肝硬化门脉高压模型制备 选取6周龄体重约180-200g雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机分成对照组和模型组.模型组大鼠予以硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)0.2g/kg腹腔注射,每周注射3次,隔天注射.对照组大鼠在相同时间点给予腹腔注射生理盐水.连续注射16-20周完成模型制备. 2.四氯化碳大鼠肝硬化门脉高压模型制备 选取6周龄体重约180-200g雄性SD大鼠,随机分成对照组和模型组.模型组大鼠予以四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)0.25ml/kg(按体积比1：3溶于橄榄油)腹腔注射,每周注射2次.对照组大鼠在相同时间点给予腹腔注射橄榄油.两组大鼠连续注射7-12周完成模型制备. 3.二甲基亚硝胺大鼠肝硬化门脉高压模型制备 选取6周龄体重约180-200g雄性SD大鼠,1%二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)生理盐水溶液按10mg/kg腹腔注射,每周注射3次,隔天注射,连续注射4周完成模型制备. 二、卡维地洛治疗大鼠门脉高压 1.选取TAA及DMN模型SD雄性大鼠,随机分成治疗对照组和卡维地洛治疗组.于肝硬化门脉高压形成后卡维地洛治疗组予以卡维地洛10mg/kg灌胃,每天1次;治疗对照组在相同时间点给予0.9%NaCl注射液灌胃.大鼠连续治疗1周. 2.所有实验动物于灌胃结束后测量门静脉压力及相关参数. 三、大鼠门静脉压力测量 使用直接穿刺测压法测定门静脉压力值,具体步骤如下：打开测压包,将玻璃管两端分别与头皮针、橡皮管连接,检查装置气密性后,用20ml注射器将玻璃管内注满肝素-生理盐水,排除气泡,血管钳夹闭橡皮管.大鼠麻醉后,打开腹腔,穿刺并插管至门静脉主干,松开血管钳,待玻璃管内水柱稳定后读数,测量三次,取平均值(cmH2O). 四、大鼠血流动力学参数检测 使用多普勒超声检测大鼠门静脉横径(portal vein diameter,PVD)及门静脉血流量(portal blood flow,PBF),具体步骤如下：大鼠麻醉后,使用15MHz线阵超声探头行腹部超声检查,取大鼠门静脉左右分支前段最大横径测PVD(mm)及门静脉血流速(portal vein time-averaged mean velocity,PVV,cm/s),测量三次,取平均值.根据PVD及门静脉流速推算PBF(ml/min).肝内血管阻力(Intrahepatic vascular resistance,IHVR)=PP/PBF. 五、大鼠肝脾体积及重量测量、肝脏标本及血清处理 大鼠称量体重(g),麻醉后眼眶取血或下腔静脉穿刺取血后离心获得血清标本,置入﹣80℃超低温冰箱冻存备用.打开腹腔,磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)充分灌注肝脏后分离获取肝脏及脾脏,称取肝脏重量(liver weight,LW,g)和脾脏重量(spleen weight,SW,g).利用50ml量筒以水测法测量大鼠肝脏体积(liver volume,LV,ml)及脾脏体积(spleen volume,SV,ml).取相同部位肝组织,置入中性甲醛固定,石蜡包埋,制备石蜡切片.其余肝脏标本,置入﹣80℃超低温冰箱冻存备用. 结果： 一、模型组及对照组大鼠肝脏组织学检测 本研究利用腹腔注射TAA、CCl4、DMN制备大鼠肝硬化门脉高压模型.造模完成后,通过肝脏大体观察、HE染色以及天狼星红染色手段确定模型组大鼠肝硬化情况,并通过测量门静脉压力确定门脉高压情况.三种不同方法模型组大鼠肝脏表面呈结节样增生;HE染色可见肝脏实质纤维组织增生、假小叶形成;通过天狼星红染色也可以发现模型组大鼠肝脏实质大量胶原沉积.对照组大鼠肝脏表面光滑,色泽饱满,未见结节样增生;HE染色可见肝脏实质为正常小叶、汇管区及小叶间隔;天狼星红染色仅在正常小叶间隔及汇管区有少量胶原沉积. 二、门静脉压力及相关参数测量结果 1.TAA大鼠肝硬化门脉高压模型 造模过程中正常对照组大鼠无死亡,模型组大鼠死亡率为37.5%.模型组大鼠所测门静脉压力值范围为11.3-19.0cmH2O,平均门静脉压力为16.4±2.9cmH2O.正常对照组大鼠所测门静脉压力值范围为8.4-14.0cmH2O,平均门静脉压力为11.1±1.6cmH2O.模型组大鼠门静脉压力值较正常对照组显著升高(P<0.001).此外,肝硬化门脉高压模型组大鼠体重(body weight,BW)较正常对照组显著下降(P<0.001).与正常对照组相比,肝硬化门脉高压模型组大鼠肝脏重量(LW)、脾脏重量(SW)、组织羟脯氨酸含量以及胶原面积比例显著升高(P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.05). 2.CCl4大鼠肝硬化门脉高压模型 造模过程中正常对照组大鼠无死亡,模型组大鼠死亡率为16.7%.模型组大鼠门静脉压力值范围为11.1-15.0cmH2O,平均门静脉压力值为12.4±1.6cmH2O.正常对照组大鼠门静脉压力值范围为8.0-8.6cmH2O,平均门静脉压力值为8.3±0.3cmH2O.与TAA肝硬化门脉高压模型大鼠类似,肝硬化门脉高压模型组大鼠体重(body weight,BW)较正常对照组显著下降(P<0.05),与正常对照组相比,肝硬化门脉高压模型组大鼠组织羟脯氨酸含量以及胶原面积比例显著升高(P<0.001,P<0.05). 三、大鼠门静脉横径及血流动力学参数结果 通过超声检测大鼠门静脉横径(PVD),CCl4大鼠肝硬化门脉高压模型组大鼠PVD范围为0.88mm-1.69mm,平均值为1.25±0.33mm;正常对照组大鼠PVD范围为0.61mm-1.16mm,平均值为0.83±0.21mm,模型组PVD明显大于正常对照组(P<0.05).此外,模型组门静脉血流量(PBF)较正常对照组明显升高(19.45±14.62ml/min vs.5.58±2.96ml/min,P<0.05). 四、卡维地洛治疗大鼠肝硬化门脉高压结果 TAA或DMN肝硬化门脉高压模型建立后,分别给予体内卡维地洛(10mg/kg,已在前期实验中完成卡维地洛剂量摸索;卡维地洛治疗组)或0.9%NaCl注射液(治疗对照组)干预,观察大鼠门静脉压力变化,结果如下： 1.TAA肝硬化门脉高压模型 正常对照组大鼠门静脉压力均值为7.08±1.75cmH2O,治疗对照组大鼠门静脉压力均值为21.14±2.48cmH2O,较正常对照组显著升高(P<0.001),卡维地洛治疗组大鼠门静脉压力均值为14.69±3.74cmH2O,较治疗对照组明显下降(P<0.01),但仍比正常对照组大鼠门静脉压力高(P<0.01).卡维地洛治疗组与治疗对照组心率(HR)、平均动脉压(MAP)、肝重体重比(LW/BW)差异无统计学意义. 2.DMN肝硬化门脉高压模型 正常对照组大鼠门静脉压力均值为7.97±1.56cmH2O,治疗对照组大鼠门静脉压力均值为14.16±1.66cmH2O,较正常对照组显著升高(P<0.001),卡维地洛治疗组大鼠门静脉压力均值为10.23±2.25cmH2O,较治疗对照组明显下降(P<0.01),与正常对照组大鼠门静脉压力相比差异无统计学意义(P=0.08).卡维地洛治疗组与治疗对照组相比心率(HR)明显降低(269±67次/分vs.349±41次/分,P<0.05),而平均动脉压(MAP)、门静脉横径(PVD)、门静脉血流量(Vmn)、门静脉血流量(PBF)、肝重体重比(LW/BW)无明显差异. 结论： 1.TAA、CCl4、DMN成功制备大鼠肝硬化门脉高压模型,TAA模型稳定,门静脉压力值高,肝纤维化程度重,但耗时长;DMN造模时间短,但大鼠死亡率高;CCl4模型造模时间、大鼠死亡率、效果居中. 2.大鼠肝硬化门脉高压模型中门静脉横径(PVD)、门静脉血流速(Vmn)、门静脉血流量(PBF)、LV/BW及肝组织胶原面积比例与门静脉压力成正线性相关. 3.卡维地洛可有效降低肝硬化门脉高压模型大鼠门静脉压力.

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