CUEDC2的表达纯化与溶液结构初步探索

摘要

CUEDC2(CUE Domain Containing2)是一个功能尚不明确的蛋白质，目前，只有两篇关于其功能的报道，都是由我中心细胞生物学实验室发表的。其中张佩景等，在发表于EMBO J.的文章中报道，CUEDC2能够和孕激素受体(PR)结合，促进孕激素诱导的受体的泛素化和降解，并并抑制乳腺痛细胞的增长，因此CUEDC2可能作为一个新的肿瘤治疗靶点具有十分重要的应用价值。李慧艳等，在发表于Nature Immunology的报道中进一步发现CUEDC2能够有效的抑制IKKβ、TRADD、TRAF2以及RIP过表达诱导的NF-κB的转录活性。目前，国内外还没有对CUEDC2结构解析的报道。为了更好的研究CUEDC2生物学功能，在分子水平上阐明CUEDC2分子与PR的作用位点。我们拟用核磁共振方法研究其三维结构。
　　 CUEDC2是一个分子量约为32KDa包含287个氨基酸的酸性蛋白质。通过生物信息学的分析表明CUEDC2包含一个CUE结构域。CUE结构域是一个约40个氨基酸的广泛存在于真核蛋白质中的结构域，具有多种功能，其中包括内质网上所合成的折叠错误和序列错误的蛋白质的降解过程。CUE结构域由三个α-螺旋折叠而成。其中α-螺旋1中的保守的MFP motif和α-螺旋3中的LL motif与泛素的疏水表面相互作用。实验证明，许多包含CUE结构域的蛋白质都能够以一种CUE结构域依赖性的方法发生泛素化，同时据文献报道CUE结构域可以形成二聚体，可以附加的结合多个泛素，因而具有较高的泛素亲和能力。许多包含CUE结构域的蛋白质既能识别单泛素化义能识别多泛素化。由于CUEDC2全长的分子量较大，我们计划将其截成2个片段，分别解析其溶液结构。
　　 本文以CUEDC2为研究对象，分别构建了多个CUEDC2的截断体，并通过优化各种表达与纯化条件，获得了高浓度、高纯度折叠较好的蛋白质样品溶液，并利用多维核磁共振技术对CUEDC2 N端包含133个氨基酸残基的结构域的溶液结构进行了初步的研究与探索。
　　 首先，我们尝试表达、纯化了GST-CUEDC(1-133aa)，但是在用凝血酶切除GST标签蛋白时，我们发现在用凝血酶酶切16小时后仍然无法将GST标签蛋白切下。于是我们考虑构建有较小的标签的克隆。我们将CUEDC2 N端的133个氨基酸构建到pET-28a载体上，并对其表达、纯化条件及蛋白质序列进行优化。最终获得了折叠状态较好的CUEDC(1-133aa)cut蛋白质样品。之后，我们优化了核磁共振的实验温度并确定了三共振实验条件。我们采集了一系列的三维核磁共振实验图谱，包括用于主链原子化学位移归属的HNCA、HNCOCA、CBCANH、CBCACONH和用于侧链原子化学位移归属的HBHACONH、CCCONH、15N-NOESY-HSQC、HCCH-COSY和HCCHTOCSY谱。然后我们利用NMRPipe软件包对谱图进行处理，利用CARA软件归属了大部分主链原子的化学位移。下一步我们将要进行侧链原子化学位移的归属，进而对CUEDC2 N端结构域的结构进行全面的解析。
　　 本文还对CUEDC2(133-287aa)蛋白进行了初步的研究。表达、纯化了GST-CUEDC(133-287aa)。并利用凝血酶对GST-CUEDC(133-287aa)酶切，除去了GST标签蛋白，获得了高浓度的CUEDC(133-287aa)蛋白样品。然后我们利用1H核磁共振谱对其结构进行初步的评价。结果表明可能由于CUEDC2(133-287aa)这个截断体中缺失了某个关键的氨基酸序列，导致其折叠构象改变，蛋白质折叠不完全。我们希望通过构建其它的CUEDC2截断体来得到C末端折叠较好的CUEDC2蛋白，进行结构研究。
　　 这些工作为全面解析CUEDC2全长的溶液结构并在分子水平上阐明CUEDC2分子与PR的作用位点和发挥功能的机理奠定了基础。