EPHX1在急性髓细胞白血病药物代谢中的机制研究及临床数据分析

摘要

目的： 急性髓细胞白血病是血液系统常见的恶性克隆性、异质性疾病，是严重危害人类生命健康的恶性克隆性血液疾病，其发生率在成人急性白血病中约占90%，5年总生存仅30%左右，缓解后复发以及耐药的问题依然存在；提高AML患者的疗效和改善其生存是目前血液领域研究的重要目标，到目前为止国内外对AML发生发展的分子调控机制及相应的诊断、治疗策略进行了大量的研究，并取得了一系列的成就；但其发生发展和复发耐药的精确分子机制尚未得到阐明。 EPHX1是一个代谢相关基因，其功能产物微粒体环氧化物酶（microsomal epoxide hydrolase,mEH）在多环芳烃环氧化合物/芳香族环氧化合物的灭活和活化中起到重要作用，可对芳香族类致癌物进行降解。由于急性髓细胞白血病（AML）的异质性，在临床治疗过程中部分患者疗效和预后较差，是否由于EPHX1在患者体内高表达，加速了芳香烃类药物降解，造成治疗效果差，带着这样的背景及问题开展了本文的研究。目前，临床上在AML的治疗中用到的大多都是多环芳香烃类化合物如阿柔比星，米妥蒽醌等。 本研究的第一部分将（1）通过体外实验研究代谢相关基因EPHX1在细胞系中的功能；（2）通过慢病毒转染改变EPHX1表达，利用RT-PCR及western检测EPHX1上、下游代谢基因CYP1A1，GSTT1和GSTM1的表达及相关凋亡基因BCL2，BAX和Caspase3的表达，初步明确EPHX1的代谢机制；（3）利用蒽环类药物研究EPHX1在药物代谢中的作用；（4）利用数据库预测分析EPHX1上游调控基因Nrf2，并通过细胞实验阐明其调控机制；第二部分通过临床样本检测，重点分析了EPHX1在初发AML中的表达及与病理参数、疗效和预后的关系，致力于为复发耐药的AML患者的治疗提供新的治疗策略。 第一部分 EPHX1在AML中的生物学功能及对药物代谢的机制研究 方法：（1）包装EPHX1干扰及过表达慢病毒载体，分别转染髓系细胞系HL60，K562及THP1，并通过RT-PCR和western验证其转染效率；（2）通过CCK8和AnnexinⅤ检测EPHX1表达改变后细胞功能的变化；（3）通过RT-PCR和western检测凋亡相关基因BCL2，BAX和Caspase3的表达，进一步验证EPHX1在细胞系中的功能；（4）利用RT-PCR和western检测干扰及过表达细胞系中CYP1A1，GSTT1和GSTM1基因与蛋白的表达，初步明确EPHX1在代谢通路中的作用；（5）在EPHX1干扰及过表达细胞系中加入蒽环类药物，在培养12h、24h、48h、72h采用CCK8的方法检测细胞增殖情况，并在48h通过AnnexinⅤ检测细胞凋亡，RT-PCR和western检测CYP1A1，GSTT1，GSTM1和BCL2，BAX，Caspase3基因及蛋白的变化，阐明EPHX1对蒽环类化疗药物代谢的影响；（6）利用在线数据库Genecard预测EPHX1上游调控基因Nrf2；（7）包装Nrf2过表达载体，转染髓系细胞系HL60，K562及THP1，并利用RT-PCR和western检测Nrf2和EPHX1基因与蛋白的表达，阐明Nrf2和EPHX1的调控关系；（8）统计分析方法：采用Graphprism5软件进行统计分析，数据以mean±SD表示,组间比较利用turky-test，P＜0.05有统计学意义。 结果：（1）EPHX1基因下调蛋白表达也随之减低（P＜0.01），且降低了细胞系HL60、K562、THP1的增殖，增加了细胞的凋亡，而过表达EPHX1细胞系蛋白表达随之增加（P＜0.01），且增殖增加，凋亡减少；（2）EPHX1下调增加了凋亡相关基因BAX，Caspase3基因与蛋白的表达（P＜0.01），而阻止凋亡的BCL2表达减低（P＜0.01）；EPHX1过表达降低了BAX，Caspase3基因与蛋白的表达（P＜0.01），而阻止凋亡的BCL2表达增加（P＜0.01）；（3）EPHX1下调可引起上游CYP1A1基因与蛋白的表达减低（P＜0.01），下游GSTT1、GSTM1基因与蛋白的表达增加（P＜0.01），过表达EPHX1可引起CYP1A1基因与蛋白的表达增加（P＜0.01），GSTT1、GSTM1基因与蛋白的表达减低（P＜0.01）；（4）在蒽环类药物用药48h后EPHX1下调的细胞增殖明显低于EPHX1高表达细胞（P＜0.01），而凋亡明显高于EPHX1高表达细胞（P＜0.01）；（5）在蒽环类药物用药48h后EPHX1下调的细胞BCL2基因与蛋白的表达明显低于EPHX1过表达细胞（P＜0.01），而BAX和Caspase3明显高于EPHX1过表达细胞（P＜0.01）；（6）在蒽环类药物用药48h后EPHX1下调的细胞中CYP1A1基因与蛋白表达明显低于EPHX1过表达细胞（P＜0.01），而GSTT1（P＜0.05）和GSTM1（P＜0.01）明显高于EPHX1过表达细胞；（7）信号通路中Nrf2的过表达可增加细胞增殖，降低细胞凋亡，而可引起EPHX1基因与蛋白的高表达（P＜0.01）。 第二部分 EPHX1在临床样本中的表达及相关数据分析 方法：（1）整理初发AML患者病例资料，从样本库中选取2010-2014年资料完整的AML白血病细胞样本113例（样本库中白血病细胞是通过Ficoll分离冻存的单个核细胞）中位年龄47（14-72）岁，男52例，女61例；（2）收集门诊骨髓样本，并选择AML完全缓解20例，相对正常的样本12例分离单个核细胞，并加Trizol混匀；（3）抽提所有样本的总RNA，并进行逆转录成cDNA，采用RT-PCR的方法检测EPHX1基因的表达，分析与疗效及预后的关系；（4）统计方法：采用Graphprism5软件进行统计分析，ROC曲线确定EPHX1在AML中表达的cut-off值，t-test与ANOVA用于不同病理参数EPHX1表达差异分析，log-rank test用于预后分析，P＜0.05有统计学意义。 结果：（1）采用ROC曲线确定EPHX1在初发AML白血病细胞中表达的cut-off值为0.56%；（2）利用t-test与ANOVA分析了EPHX1表达与病理参数的相关性，包括年龄、性别、白细胞、血红蛋白、血小板、原始细胞、FAB分型，以及危险分层等，发现EPHX1的表达水平与AML危险分层存在明显的相关性（P=0.0477）；（3）EPHX1高表达组AML患者达到完全缓解的时间较EPHX1低表达组（P＜0.0001）；（4）EPHX1高表达组的累计复发率（CIR）明显高于EPHX1低表达组（P=0.0056）；（5）EPHX1高表达组的总生存（OS）明显低于EPHX1低表达组（P=0.0058）；（6）mEH，Nrf2，CYP1A1基因及蛋白在复发难治AML细胞中呈明显高表达（P＜0.01），而GSTT1，GSTM1表达减少（P＜0.01）。 结论：（1）EPHX1是一个功能性基因，其表达的变化可引起蛋白质的改变，进而可影响细胞的增殖、凋亡；（2）EPHX1基因表达变化可对代谢通路中CYP1A1、GSTT1和GSTM1基因和蛋白质进行调控；（3）EPHX1基因的高表达可明显降低蒽环类化疗药物的作用效果；（4）EPHX1下调可引起凋亡相关基因及蛋白BCL2表达减低，而BAX，Caspase3表达增加，用药后也是如此；（5）EPHX1受信号通路中上游调控因子Nrf2的调控；（6）临床样本中EPHX1的表达与预后分层相关，且高表达AML患者疗效及预后都较差；（7）mEH，Nrf2，CYP1A1在复发难治AML中高表达，GSTT1，GSTM1表达减低；（8）EPHX1可成为AML新的潜在的治疗靶点，尤其对于一些复发耐药的AML患者。

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