小麦全蚀病菌胞外β-1，3-葡聚糖酶Ⅱ的分离纯化及性质研究

摘要

小麦全蚀病是一种世界范围内普遍发生的重要根部病害和重点防治对象，给小麦生产带来重大的损失。由于全蚀病的致病机理研究还很薄弱，加之目前尚无有效的抗性品种和化学药剂，全蚀病的防治仍是小麦生产中的一大难题。　　小麦全蚀病菌致病机理的研究显示，病菌侵染麦根的过程，不仅与纤维素酶和木聚糖酶等细胞壁降解酶有关，还可能涉及胞外β-1,3-葡聚糖酶。因此，本研究小组对小麦全蚀病菌胞外β-1，3-葡聚糖酶进行了系统研究，其目的是为进一步全面揭示小麦全蚀病菌致病过程的细胞化学和分子生物学机理奠定基础，同时也为进一步开展抗全蚀病的生物工程研究提供理论依据。本论文在课题组前期工作的基础上，对全蚀菌产生的胞外β-1,3-葡聚糖酶同工酶进行了分离纯化和酶学性质研究，取得以下重要研究结果表明：　　1.硫酸铵梯度沉淀研究发现，55﹪饱和度的硫酸铵就基本可以将小麦全蚀病菌液体振荡培养液中的目的蛋白全部析出。　　2.小麦全蚀病菌产生的胞外β-1，3-葡聚糖酶主要存在两种同工酶(β-1，3-葡聚糖酶Ⅰ和β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ)，并且β-1，3-葡聚糖酶Ⅱ的表达量相对较大，β-1，3-葡聚糖酶Ⅰ的表达量较小。　　3.粗酶液经SephadexG-150凝胶过滤层析分离，出现两个紫外光吸收峰，各收集部分酶活力也出现两个主要吸收峰，根据各收集部分的酶活力大小及它们在层析图谱上所出现的位置，证实粗酶液主要含有两种β-1,3-葡聚糖酶同工酶。　　4.经过非变性PAGE分离胶浓度的筛选，确定了达到两种β-1，3-葡聚糖酶同工酶的最佳分离效果的分离胶浓度为7.5﹪。　　5.电洗脱回收了经非变性PAGE(分离胶浓度为7.5﹪、浓缩胶浓度为3.9﹪)分离的同工酶(表达量较大的GluⅡ)，经电泳检测达到电泳纯。　　6.β-1，3-葡聚糖酶Ⅱ由两个亚基组成，它们的分子量分别为63.2KD和73.7KD。　　7.β-1，3-葡聚糖酶Ⅱ的等电点为8.6。　　8.β-1，3-葡聚糖酶Ⅱ最适反应温约为50℃，在＜60℃时比较稳定；最适反应pH值5.0左右，pH4.0～7.0较稳定；Mn2+对其酶活力有显著的激活作用，而Co2+，Hg2+对其酶活力有明显的抑制作用，Mg2+对该酶酶活力有轻微的抑制作用，Fe3+，Zn2+，Ca2+，Ba2+对酶活力基本没有影响。

目录

文摘

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前言

第一章文献综述

1.1小麦全蚀病

1.1.1小麦全蚀病的发现与国内外发生概况

1.1.2小麦全蚀病菌

1.1.3小麦全蚀病防治研究现状

1.2小麦全蚀病菌在侵染过程中与寄主的互作

1.2.1病菌的生长和侵染

1.2.2病原菌和寄主之间的互作

1.3植物病原真菌产生的B-1，3-葡聚糖酶研究进展

1.3.1植物病原真菌β-1，3-葡聚糖酶的调节

1.3.2真菌β-1，3-葡聚糖酶在真菌生长发育中的作用

1.3.3植物病原真菌β-1，3-葡聚糖酶在致病过程中的作用

1.3.4植物病原真菌β-1，3-葡聚糖酶纯化和理化性质

第二章材料和方法

2.1材料

2.1.1菌种和培养基

2.1.2主要仪器与试剂

2.1.3蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂

2.2方法

2.2.1菌种的复壮

2.2.2液体发酵培养方法

2.2.3酶活力测定方法

2.2.4蛋白含量的测定方法

2.2.5酶的分离与纯化

2.2.6酶性质的研究

第三章结果与分析

3.1合适盐析浓度的确定

3.2粗酶液的非变性PAGE检测

3.3 B-1，3-葡聚糖酶Ⅱ的纯化

3.3.1柱层析法

3.3.2β-1，3-葡聚糖酶Ⅱ的电洗脱回收

3.4 B-1，3-葡聚糖酶Ⅱ的酶学性质

3.4.1 SDS-PAGE测定分子量

3.4.2β-1，3-葡聚糖酶Ⅱ的等电点

3.4.3最适反应温度及热稳定性

3.4.4最适反应及pH稳定性

3.4.5金属离子对β-1，3-葡聚糖酶Ⅱ活力的影响

3.4.6酶的Vmax及Km

第四章讨论

第五章结论

致谢

参考文献

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