鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG5和SAG10基因的克隆与表达及免疫保护性试验

摘要

鸡球虫病是由艾美耳属的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)等7种球虫单独或混合感染肠道不同部位所引起的一种肠道细胞内寄生性原虫病。目前使用抗球虫药是防治肉仔鸡球虫病的主要手段，但抗药性和药物残留等问题限制了球虫药物的广泛应用。从长远观点出发，基因工程苗和核酸疫苗是最终控制鸡球虫病的必然选择，而鸡球虫保护性抗原基因的筛选是研制基因工程苗及核酸疫苗研究的基础。入侵相关蛋白是目前研究较多的球虫抗原，主要包括子孢子/裂殖子表面蛋白、以及微线、棒状体、折光体等分泌型亚细胞器抗原。Tomley等(2004)分析了来自E.tenella的子孢子和第二代裂殖子的EST序列，得到了潜在的具有GPI锚定结构域的表面抗原的mRNA序列，研究表明只有一种特定的EtSAGs在子孢子上表达，小部分在两个阶段都有表达，而大部分主要在第二代裂殖子上表达。本研究对鸡E.tenella表面抗原SAG5、SAG10基因(二者均在子孢子入侵和裂殖子生殖阶段有表达)进行了克隆与原核表达，为进一步研究其免疫原性及其它生物学功能奠定基础。 (1)本研究根据Tomley等报道的E.tenella豪顿株的SAG5、SAG10基因设计特异性引物，以RT-PCR方法克隆了E.tenella杨凌株SAG5、SAG10基因序列(GenBank Locus：EF635426、EF649989)，分别与豪顿株相比，核苷酸序列以及推导的氨基酸序列同源性均达98％以上，这说明SAG5、SAG10基因在不同地理株之间有很高的保守性，而现阶段并没有试验证明他们在与宿主细胞之间的相互作用关系以及是否具有一定免疫原性，有待进一步试验证明。同时用SMART RACE技术获得SAG10基因的全长cDNA。 (2)扩增了不含N端疏水性信号肽序列SAG5、SAG10基因，并将其克隆至表达载体上，转化大肠杆菌Rosetta菌，经IPTG诱导，实现其在宿主菌Rosetta中表达。先前表达的以pET-32a(+)为载体的SAG10蛋白为包涵体形式存在于菌体细胞内，通过不断反复摸索表达条件，通过更换pMAL-c2X为表达载体获得了可溶性的融合蛋白，并结合Amylose Resin层析获得较高浓度的目的蛋白。 (3)用ELISA方法以及鸡只抗球虫感染动物实验，分别检测和统计了鸡只体内重组蛋白免疫后相应抗体效价水平和盲肠病变记分、测定克盲肠内容物卵囊数(OPG)、增重、综合抗球虫指数(ACI)等相关抗球虫感染指标。证明了重组蛋白免疫后能在机体内产生一定的抗体水平和抗球虫感染保护力。

目录

文摘

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论文说明：缩略语英文对照表

声明

第一章鸡球虫病免疫防治与相关疫苗的研究进展

1.1概述

1.2鸡球虫的免疫防治研究进展

1.2.1球虫侵入性抗原的研究

1.2.2宿主免疫应答

1.3鸡球虫病疫苗研究进展

1.3.1鸡球虫活卵囊疫苗

1.3.2基因工程疫苗

1.3.3展望

第二章柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG5、SAG10的基因序列分析及SAG10全长cDNA的扩增

2.1材料

2.1.1试验动物和饲料

2.1.2实验所用虫株

2.1.3菌株、载体

2.1.4分子生物学试剂和试剂盒

2.1.5培养基及配制

2.1.6引物

2.1.7主要试剂

2.1.8 CaCl2法转化用材料

2.1.9琼脂糖凝胶电泳所需材料

2.2方法

2.2.1裂殖子的纯化

2.2.2裂殖子总RNA的提取

2.2.3 SAG5、SAG10基因的RT-PCR

2.2.4 RT-PCR产物的回收纯化

2.2.5 RT-PCR产物与pGEM-T-easy的连接

2.2.6连接产物转化E.coli DH5 α(CaCl2法)

2.2.7转化克隆的PCR鉴定

2.2.8 PCR阳性克隆的酶切鉴定

2.2.9阳性克隆的序列测定及分析

2.2.10 SAG10的RACE扩增

2.3结果

2.3.1 SAG5、SAG10的RT-PCR结果

2.3.2转化菌落的PCR鉴定

2.3.3重组质粒pGEM-T-Easy-SAG5/SAG10的酶切鉴定

2.3.4 SAG5、SAG10基因的序列分析

2.3.5 RACE结果

2.4讨论

2.4.1表面抗原SAG5/SAG10基因的扩增

2.4.2抗原SAG5/SAG10亲水性、抗原指数等分析

2.4.3表面抗原SAG10基因全长cDNA的扩增

2.5小结

第三章柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG5和SAG10在大肠杆菌中的表达

3.1材料

3.1.1主要仪器

3.1.2菌株、载体

3.1.3引物

3.1.4常用分子生物学试剂和试剂盒

3.1.5常规化学试剂

3.1.6 CaCl2法转化所需材料

3.1.7培养基

3.1.8 SDS-PAGE所需材料

3.1.9免疫印迹所需材料

3.1.10融合蛋白纯化所需材料

3.2方法

3.2.1 N端不含信号肽序列的SAG5、SAG10基因片段的扩增

3.2.2载体的制备

3.2.3 pET-32a(+)、pMAL-c2X与SAG5/SAG10的连接

3.2.4用CaCl2法将连接产物转化入宿主细菌E. coli Rosetta(DE3)

3.2.5转化克隆的PCR鉴定

3.2.6 PCR阳性克隆的酶切鉴定

3.2.7SAG5/SAG10在E.coli Rosetta(DE3)的诱导表达

3.2.8重组蛋白的大量表达和纯化

3.2.9蛋白质浓度与纯度的检测

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

第四章SAG5/SAG10融合蛋白的免疫原性和保护性实验

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

结论

参考文献

致 谢

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