东方粘虫细胞原代培养及几种天然活性物质的细胞毒性测定

摘要

以东方粘虫不同虫态为材料，原代培养了血淋巴细胞、脂肪体细胞、胚胎细胞、中肠细胞。以培养的东方粘虫中肠细胞和棉铃虫卵巢细胞为供试细胞测试了苦皮藤素V、白鲜碱、梣皮酮和一系列苦皮藤素衍生物的细胞毒性。结果如下： 1.细胞培养 对血淋巴细胞培养发现M199培养基较TNM-FH培养基和Grace's培养基适合血淋巴细胞生长。接种半小时的血淋巴细胞培养基呈黑色，多次更换培养基后，培养基颜色趋于正常，一个月后细胞开始生长，三个月后细胞出现克隆堆。 对来自东方粘虫蛹的脂肪体细胞进行了原代培养，得到了圆形和梭形两种细胞。经比较发现M199培养基不利其生长，而在Grace's培养基和TNM-FH两种培养基中生长良好，圆形细胞呈卵粒状排列生长，有接触抑制现象。梭形细胞较圆形细胞生长缓慢且贴壁较紧，不利其传代培养。 对中肠细胞培养发现TNM-FH培养基较Grace's培养基和M199培养基利于中肠细胞生长。中肠细胞在培养基中呈疏松状贴壁生长，一个月后细胞成活率变得稳定，半年后，部分圆形细胞以其自身为中心分化出梭形细胞，梭形细胞生长缓慢，每生长一代大约需要三个月。 对来自卵的胚胎细胞培养发现TNM-FH培养基较适合胚胎细胞生长，细胞圆形，贴壁生长，圆形细胞在一个月左右生长形成网状纤维束。经过两个多月的培养，纤维束周围有大量圆形细胞生长。六个月后，部分圆形细胞出现分化现象，分化出梭形细胞，但该梭形细胞较脂肪体细胞和中肠细胞分化的梭形细胞大，随着培养时间的延长，在梭形细胞的周围可以看到一些小的圆形细胞。 2.细胞毒性测定采用MTT比色法、中性红摄取法和台盼蓝拒染法测定了天然活性物质苦皮藤素V、白鲜碱和梣皮酮对东方粘虫中肠细胞的毒性。在MTT比色法中，确立了甲臜结晶裂解液酸化异丙醇溶液的测试波长为558 nm，10％SDS裂解液的测试波长为568 nm，二甲亚砜的测试波长为497 nm。在本实验中用二甲亚砜做为甲躜结晶裂解液，选用492nm做为酶标仪的测试波长。MTT比色法、中性红摄取法和台盼蓝拒染法测得的苦皮藤素V对粘虫中肠细胞的LC<,50>分别为9.08、7.79和10.94.mg·L<'-1>；白鲜碱为27.85、31.77和36.42 mg·L<'-1>；梣皮酮为186.66、164.00和189.43 mg·L<'-1>；3种化合物相对而言，苦皮藤素V对中肠细胞毒性最强，白鲜碱次之，而梣皮酮较差。 采用MTT比色法测定了15个苦皮藤素衍生物对棉铃虫卵巢细胞的毒性，结果表明： 在这15个衍生物中，有6个衍生物的LC<,50>均小于100 mg·L<'-1>，且丙酮保护甲醚的效果最好，其LC<,50>为37.51 mg·L<'-1>；有5个衍生物的效果较差，并且衍生物丙酮保护苄醚效果最差，其LC<,50>为232.63 mg·L<'-1>。在6个双呋喃衍生物和4个丙酮保护衍生物中，呈现出衍生物基团越大，活性越差的现象。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1细胞培养技术发展概述

1.2昆虫细胞培养概述

1.2.1昆虫细胞培养基概述

1.2.2昆虫细胞系的研究进展

1.2.3粘虫细胞系的研究进展

1.3昆虫细胞系的应用

1.3.1昆虫细胞系在病毒学研究中的应用

1.3.2昆虫细胞系在药理学研究中的应用

1.3.3昆虫细胞系在毒性测定和药物筛选中的应用

1.4论文设计思路

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1昆虫细胞培养基和血清

2.1.2昆虫细胞系

2.1.3供试昆虫

2.1.4供试药剂

2.1.5主要供试试剂

2.1.6仪器设备

2.2试验方法

2.2.1试剂的配制

2.2.2昆虫细胞培养基的配制

2.2.3细胞分离与培养

2.2.4细胞毒性测定

第三章结果与分析

3.1细胞培养

3.1.1血淋巴细胞的培养

3.1.2脂肪体细胞的培养

3.1.3中肠细胞的培养

3.1.4胚胎细胞的培养

3.1.5棉铃虫卵巢细胞的复苏

3.2细胞毒性测定

3.2.1 MTT比色法测试波长的确定

3.2.2三种植物源活性物质对东方粘虫中肠细胞的毒性

3.2.3.苦皮藤素衍生物对棉铃虫卵巢细胞的毒性

第四章讨论

4.1细胞培养基的选择

4.2血清对细胞培养的影响

4.3东方粘虫细胞培养的取材

4.4培养细胞的多态性

4.5培养细胞的毒性测定

4.6细胞毒性测定三种方法的比较

4.7细胞毒性与衍生物基团的关系

第五章结论

5.1东方粘虫细胞培养

5.2细胞毒性测定

参考文献

致谢

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