鸡传染性法氏囊病病毒强弱毒株的鉴别及VP2基因在大肠杆菌中的表达

摘要

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏囊，不但会使感染鸡致病死亡，生产性能下降，而且还可致雏鸡免疫抑制，导致鸡群对新城疫、马立克病及传染性支气管炎等多种重要疫病的免疫失败，引起了世界禽病工作者的高度重视，是目前危害世界养禽业的主要传染病之一。尤其是20世纪80年代中期以后出现的超强毒株(vvIBDV)，能使感染鸡的死亡率达到60％以上，给世界养禽业带来了严重的经济损失。 1957年该病首次在美国特拉华州的甘布罗镇(Gumboro)的肉鸡群中发生。最初分离到的病毒发病率高，但致死率通常在2％～5％，偶尔达20％～30％，这种病毒株称之为标准毒IBDV(vIBDV)。20世纪80年代后期，美国出现了与标准毒在抗原性上有明显差异的变异株。欧洲国家首先报道了致死率高达90～100％的超强毒(vvIBDV)，90年代初传至中国及亚洲其他地区。vvIBDV感染现己遍布于全球主要养禽地区，在工业化养鸡业发达的国家尤为严重。 IBDV是双链RNA病毒，属于双RNA病毒科(Biranviridae)禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)，无囊膜，呈二十面体对称，病毒粒子直径60nm。其基因组由A、B两个节段组成。B节段(约218kb)编码VP1蛋白，为RNA依赖的RNA聚合酶。A节段(约313kb)具有两个相互重叠的开放阅读框(ORE)，下游的ORF1编码的前体蛋白VP2/VP4/VP3可进一步剪切加工为VP2、VP4及VP3。其中VP2是病毒的主要宿主保护性抗原，与病毒的抗原变异和毒力相关；VP4为一种丝氨酸蛋白酶，负责前体蛋白VP2/VP4/VP3的自我剪切；VP3是病毒的结构蛋白之一，具有群特异性抗原。上游的ORF2(438bp)编码非结构蛋白VP5(约15ku)，该蛋白非病毒复制所必需，与病毒致病性有关。IBDV不同毒株氨基酸的差异主要发生于VP2区特别是206至305个氨基酸，称之为VP2高变区，是抗原性的主要部位。这段区域内不同毒株间的变异很大，其分子结构的改变常导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变，使得传统的疫苗不能控制其流行。在VP2基因高变区内包括2个亲水区和1个七肽区。亲水区是变异发生的热点部位，对于超强毒株抗原性极为重要。 本研究区分了IBDV超强毒株和强毒、疫苗株，并在大肠杆菌中表达了IBDV的VP2基因，获得了以下结果： 1．RT-PCR辅助限制性内切酶方法鉴别IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株首先根据GenBank上IBDV VP2基因组的保守序列设计一对引物，利用RT-PCR扩增出大小为802bp的PCR产物。对比分析了IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株基因组PCR产物的酶切位点，选出Aha I、Stu I和BamH I、Nsp I两组限制性内切酶。分别对超强毒株、强毒株及疫苗株进行酶切，以区分超强毒株、强毒株及疫苗株。结果表明，超强毒株能被Aha I、Stu I切出327bp的片段，而强毒株及疫苗株则只能被．BamH I、NspI切出270bp的片段。这种方法能够准确、快速地检测出发病是否由IBDV超强毒株引起，为IBD的诊断提供了一种新的手段。 2．IBDV VP2基因的原核表达根据IBDV陕西地区分离株的VP2基因的cDNA为模板，设计相应引物进行扩增。得到的目的基因连接到pET-32α原核表达载体中，得到重组质粒pET-VP2。经过PCR、酶切及测序分析，确定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确，与预期序列相符。再将重组质粒转化到大肠杆菌JM109中，IPTG诱导表达得到分子质量约为60ku的目的蛋白，为制备抗VP2蛋白的单克隆抗体提供了基础材料。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语英汉对照表

声明

第一章鸡传染性法氏囊病的研究进展

1.1概述

1.2 IBDV的基因组结构及病毒蛋白

1.2.1 VP1蛋白

1.2.2 VP2蛋白

1.2.3 VP3蛋白

1.2.4 VP4蛋白

1.2.5 VP5蛋白

1.3病毒抗原变异和毒力差异的分子基础

1.3.1 IBDV抗原性变异的分子基础

1.3.2 IBDV毒力变异的分子基础

1.4 IBDV疫苗研制、免疫途径及免疫失败的原因

1.4.1 IBD疫苗种类

1.4.2免疫程序

1.4.3免疫途径

1.4.4免疫失败的原因

1.5国内研究进展

第二章RT-PCR快速鉴别IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株的研究

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1 VP2基因的RT-PCR扩增

2.2.2酶切鉴定结果

2.3讨论

第三章传染性法氏囊病病毒VP2基因的原核表达

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1 PCR扩增结果

3.2.2克隆载体pMD-18T-VP2的鉴定

3.2.3原核表达载体pET-VP2的鉴定

3.2.4 VP2蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析

3.3讨论

参考文献

致谢

作者简介