中国部分地方水牛品种mtDNA D-loop区遗传多样性与起源研究

摘要

本研究采用单链构象多态性(SSCP)方法并结合测序技术对10个中国地方水牛品种(贵州青水牛、涪陵水牛、江汉水牛、恩施山地水牛、西林水牛、陕南水牛、海子水牛、温州水牛、东流水牛、峡江水牛)150头个体线粒体DNAD-loop序列基因(约930bp)的多态性进行研究，结果表明： 我国地方水牛品种在线粒体DNA D-loop区第一高变区(HV1)的变异率较高。通过SSCP方法显示出6种单倍型，据此确定了110个测序个体。测序结果共发现了50种单倍型，107个多态位点(简约多态位点73个，单一多态位点34个)，约占核苷酸序列的11.50％，其单倍型多样度(haplotype diversity，Hd)为0.8952±0.0240，核苷酸多样度(nucleotide diversity，π)为0.0200±0.0056，平均核苷酸差异(average number of nucleotide difIferences，k)为18.4450，在不同品种之间，差异极显著，其中江苏海子水牛的单倍型多样度、核苷酸多样度和平均核苷酸差异是最高的，其次为贵州青水牛，温州水牛和江汉水牛，其他品种则较低。 在这50种单倍型中，43种为各品种特有的单倍型，7种为品种间共享的单倍型。最大的共享单倍型H1包含除江苏海子水牛之外9个品种的33个个体，单倍型H26、 H41和H43均包含5个以上个体，单倍型H2、H6、H22、H24、H27、H34、 H48均包含2个或2个以上个体，其余单倍型均只有一个个体。中国地方水牛的单倍型数目在每个品种中分布不同，最小为5，最大为9；其单倍型多样度和核苷酸多样度分别为0.8332-1.0000和0.0096-0.0327，这些都表明中国水牛具有丰富的遗传多样性。 以GenBanK上公布的江河型印度摩拉水牛D-loop序列(AF197215)为外群，用MEGA3.1和Network 4.2.0.1软件对中国地方水牛50种mtDNA单倍型进行亲缘关系和系统进化分析，构建的NJ系统树表明中国水牛都属于沼泽型水牛，并且包含了2个母系起源，分别命名为A支系和B支系，以此确定了区分两个支系的基本变异位点。其中A支系包含了所有研究品种中的36个单倍型的78个个体，分别占到了总数的72％和70.9％，居主导地位。B支系虽然在分布上不如A支系广泛，但是在单倍型和核苷酸的多样度上要比A支系丰富。除峡江水牛只有A支系外，其他9个中国地方水牛品种在A支系利B支系中均有分布，表明了mtDNA的起源与各品种之间的地理分布没有必然联系。 对所选的10个品种从整体上进行核苷酸misnmtch分布发现：这些品种种没有经过群体扩张；但是对分别处于支系A和支系B聚类分支的个体进行mismatch分布发现：支系A的母系来源经过群体扩张，支系B没有经过群体扩张。

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前言

第一章文献综述

1.1中国牛的起源

1.2 mtDNA多态性在物种上的研究与应用

1.2.1在牛亲缘关系和起源进化中的研究

1.2.2在羊亲缘关系中的应用

1.2.3在其它物种中的应用

1.2.4线粒体DNA在牛种质资源保护方面的应用

1.2.5线粒体DNA在牛生产性能分析上的应用

1.3中国水牛品种的形成以及遗传多样性和起源的研究

1.4线粒体DNA研究进展

1.5基因多态性的检测方法

第二章试验材料与方法

引言

2.1试验材料

2.1.1试验样本采集

2.1.2主要仪器设备

2.1.3主要试剂

2.1.4试验主要试剂的配制

2.2试验方法

2.2.1牛血液基因组DNA提取步骤

2.2.2 DNA浓度和纯度的检测

2.2.3引物设计和PCR扩增

2.2.4聚丙烯酰胺(PAGE)电泳的步骤

2.2.5银染步骤

2.2.6 PCR产物的纯化回收

2.2.7数掘处理

第三章结果与分析

3.1 mtDNA D-loop序列的PCR扩增结果

3.2 D-loop序列的SSCP电泳结果

3.3序列比对结果与分析

3.4 50种单倍型构建的NJ树

3.5中国部分水牛品种间平均遗传距离

3.6系统进化分析

3.7群体扩张分析

第四章讨论与结论

4.1讨论

4.1.1SSCP应用于mtDNA多态性研究的可行性

4.1.2中国地方水牛mtDNA D-loop的遗传多样性分析

4.1.3中国水牛的起源分析

4.1.4不同聚类方法的比较

4.2结论

参考文献

附录

致谢

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