犬瘟热病毒H基因的克隆表达与分子流行病学研究

摘要

犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一种以犬为主的多种动物共患急性传染病，对动物的危害很大。CDV基因组编码核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、大蛋白(L)、融合蛋白(F)和血凝蛋白(H)6个蛋白，其中H蛋白是CDV感染细胞过程中侵袭宿主所必需的，也是产生中和抗体的主要抗原，同时也是变异最大的结构蛋白；分析和研究H蛋白的分子进化和变异情况能反映CDV的流行和进化趋势。虽然之前开发的犬瘟热弱毒疫苗已被广泛使用并取得很好的保护效果，但是近来犬瘟热又在全世界流行，疫苗免疫失败的现象越来越多。出现这种现象的原因一方面可能是在免疫压力下，CDV抗原表位可能发生漂移，尤其是主要结构蛋白H蛋白极易发生变异，从而使疫苗失去效用；另一方面也可能由于免疫失败或者动物机体的抗体水平下降而导致机体在受到CDV感染时不能产生有效的保护。本研究旨在探明杭州地区CDV的流行特征和变异趋势，为疫苗的选择或开发奠定基础；同时，表达H蛋白用于动物机体的免疫状况的监测，为犬瘟热的防治提供参考。为此，2007年1月至2008年4月间我们收集了44份临床疑似犬瘟热病料并进行PCR检测，克隆测序13株CDV H基因序列，用于遗传进化分析；同时截短表达H蛋白，并进行免疫印迹试验以确证该重组蛋白的反应原性。 1.根据CDV N基因的保守区域设计引物，在对RT-PCR法和反转录-套式PCR扩增的N基因片段克隆测序的基础上，比较了两种检测方法的灵敏性和特异性。结果显示，PCR扩增片段和测序结果与预期一致，特异性分析表明两种检测方法对犬细小病毒阳性病料无扩增条带，具有很高的特异性，RT-PCR法和反转录.套式PCR法的阳性检出率分别为11.36％和63.64％，反转录.套式PCR法比RT-PCR法更加敏感。 2.为了进一步探明杭州地区CDV的流行特征和变异趋势，克隆测序了13份CDV阳性病料的H基因。分子遗传进化分析显示，所有毒株可分为7个大的分支，且各分支间具有一定的地域相关性。亚洲国家主要存在CDV Ⅰ型和Ⅴ型，但在中国未发现Ⅴ型毒株的存在；杭州毒株除一株属于Ⅶ型外，其余与中国大部分毒株同处于Ⅰ型，而只有少量中国毒株属于Ⅵ型和Ⅶ型。潜在的天冬酰胺糖基化位点分析发现不同毒株之间的数目差距较大，疫苗株含4～7个糖基化位点，野毒株为7～9个；杭州地区的毒株除HZ005为8个和HZ011为6个外，其余均为9个。进一步分析了H基因变异情况，发现H基因整体变异较大，但氨基酸同义置换的概率大于非同义置换的概率，表明H基因同义突变的趋势更加明显。 3.利用MDCK细胞从临床犬瘟热病犬病料中分离CDV，结果表明第3、6、9和12代感染细胞均能检测到病毒特异性条带(病毒命名为HZ026)，其原代病毒和第12代病毒的H基因测序分析显示在传代过程中H基因没有发生变异。进一步截短表达H基因的两个片段，Western blot鉴定表明，表达的蛋白对于CDV阳性血清具有较强的反应原性，可用于进一步的血清学研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述第一章犬瘟热研究进展

1.1犬瘟热概述

1.1.1犬瘟热的发现与流行病学特点

1.1.2致病机理

1.1.3 临床症状与病理变化

1.1.4检测与诊断

1.2犬瘟热病毒概述

1.2.1 CDV的形态

1.2.2 CDV的理化特征

1.2.3 CDV的细胞受体

1.2.4 CDV的分离

1.2.5 CDV的基因组结构

试验研究第二章犬瘟热病毒反转录-套式PCR检测方法的建立

2.1材料

2.1.1病料

2.1.2 工具酶和主要试剂

2.1.3主要仪器与设备

2.2方法与步骤

2.2.1引物设计

2.2.2病毒总RNA的提取

2.2.3反转录

2.2.4 RT-PCR检测

2.2.5套式PCR检测

2.2.6套式PCR检测CDV核酸方法的特异性

2.2.7扩增产物的纯化

2.2.8 TA克隆

2.2.9序列测定

2.3结果

2.3.1 临床症状与病理变化

2.3.2 RT-PCR产物的电泳结果

2.3.3目的片段的克隆与鉴定

2.3.4反转录-套式PCR检测方法的特异性

2.3.5 RT-PCR与反转录-套式PCR的检测结果与比较

2.4讨论

2.4.1 CDV N基因

2.4.2检测方法的特异性

2.4.3反转录-套式PCR检测CDV方法的建立

2.5小结

试验研究第三章基于H基因的杭州地区CDV分子流行病学调查

3.1材料

3.1.1菌株、工具酶和主要试剂

3.1.2主要仪器与设备

3.1.3病料来源

3.2方法与步骤

3.2.1不同CDV毒株H基因的扩增和测序

3.2.2 H基因全长的序列分析

3.3结果

3.3.1 RT-PCR产物的电泳结果

3.3.2目的片段的克隆与鉴定

3.3.3 H基因的序列分析

3.4讨论

3.4.1 H基因的遗传进化分析

3.4.2 H基因的变异分析

3.5 小结

试验研究第四章犬瘟热病毒HZ026株的分离及其H基因的克隆表达

4.1材料

4.1.1病料、质粒与菌株

4.1.2主要试剂和仪器设备

4.1.3细胞及培养液

4.2方法与步骤

4.2.1病例的处理

4.2.2细胞的预处理和病毒的分离

4.2.3病毒的鉴定和CDV传代后H基因的变异分析

4.2.4引物设计

4.2.5目的基因片段的RT-PCR扩增

4.2.6目的基因的克隆、鉴定及表达载体的构建

4.2.7重组质粒在大肠杆菌中的表达

4.2.8重组蛋白的纯化

4.2.9 Western b1ot分析

4.3结果

4.3.1病毒的分离鉴定

4.3.2 CDV传代后H基因的变异

4.3.3目的片段的PCR扩增

4.3.4重组质粒的鉴定

4.3.5重组蛋白的表达

4.3.6纯化蛋白的免疫反应原性分析

4.4讨论

4.4.1 CDV的分离鉴定

4.4.2 CDV传代后H基因变异情况

4.4.3影响目的蛋白表达的因素

4.4.4病毒的来源分析

4.4.5表达蛋白的免疫反应原性分析

4.5 小结

结论

参考文献

致谢

个人简介