苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的分离纯化与抑菌作用研究

摘要

植物的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)可与病源菌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)特异结合，抑制病原菌侵染，因此具有抗病作用。本研究的目的旨在从苹果果皮中分离纯化出PGIP并对其进行抑菌作用研究，从而为PGIP基因及其表达产物的进一步利用奠定基础。 本研究以西北农林科技大学园艺试验场的膨大期的富士苹果果皮为材料，经醋酸钠缓冲液抽提，35％-75％(NH4)2SO4分级分离沉淀、醋酸钠缓冲液透析、CM-Sephadex C-50阳离子交换层析、聚乙二醇6000浓缩、Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤分离纯化出PGIP并对其分子量、活性及抑菌作用等性质进行分析，主要结果如下： 1、建立了苹果果皮PGIP的提取与纯化方法2000 g膨大期的苹果果皮经匀浆、pH5.5，25 mmol/L乙酸钠缓冲液(含5×10-5mol/LEDTA-Na2、0.7μg/ml胃蛋白酶抑制剂、1.5％PVP、174μg/ml PMSF、10 mmol/L DTT)缓冲液抽提、35％～75％硫酸铵沉淀、醋酸钠缓冲液透析、聚乙二醇6000浓缩、CM-Sephadex C-50阳离子交换层析和Sephadex G-100分子筛凝胶过滤层析分离纯化出0.7 mg苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白。 2、首次通过实验证实了PGIP对病原真菌PG和病原菌生长的抑制作用纯化出的PGIP对苹果褐腐菌(Monilinia fructlgena)PG有较强的抑制作用,对苹果褐腐菌(Monilinia fructigena)的最初生长有抑制作用，使其菌丝生长稀疏，生长势弱。正常生长的苹果褐腐菌(Monilinia fructigena)遇到PGIP后出现波浪状异常生长情况，所以PGIP对苹果褐腐菌(Monilinia fructigena)的继续生长具有抑制作用。

目录

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声明

第一章文献综述

1.1引言

1.2植物抗病的分子机理

1.3植物抗真菌病害的方法

1.3.1对病原菌直接表现毒性或抑制病菌生长的基因产物的表达

1.3.2破坏或中和病菌毒性产物的基因产物的表达

1.3.3改变可潜在的增强植物结构抗性的基因产物的表达

1.3.4调节植物防御反应的信号分子基因产物的表达

1.3.5与过敏性坏死反应及无毒因子(Avr)有关的抗性基因产物的表达

1.4多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白研究进展

1.4.1 PGIP的发现及其功能

1.4.2 PGIP的生化性质

1.4.3 PGIP在植物抗病中的作用

1.4.4 PGIP含量、分布的差异与植物抗性强弱的关系

1.4.5 NCBI蛋白数据库中收录的现况分析

1.4.6 PGIP的分离纯化研究进展

1.5论文选题的目的与意义

第二章材料和方法

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌种

2.1.3主要试剂、材料及配方

2.1.4培养基的配置

2.2方法

2.2.1苹果PGIP(NH4)2SO4盐析分离最适饱和度的确定

2.2.2阳离子交换树脂吸附苹果PGIP的溶液pH选择

2.2.3苹果PGIP阳离子交换层析洗脱条件的选择

2.2.4苹果果皮PGIP的提取与分离纯化

2.2.5蛋白质含量测定

2.2.6苹果PGIP性质分析

2.2.7苹果PGIP对苹果褐腐菌(Monilinia fructigena)的抑制作用研究

第三章结果与分析

3.1苹果PGIP分离纯化条件优化

3.1.1 (NH4)2SO4盐析分离最适饱和度的确定

3.1.2阳离子交换树脂吸附苹果PGIP的溶液pH选择

3.1.3苹果PGIP阳离子交换层析洗脱条件的选择

3.2苹果果皮PGIP的提取与分离纯化

3.2.1苹果果皮PGIP的提取

3.2.2苹果果皮PGIP的分离纯化

3.2.3分离纯化过程中PGIP的定量

3.3苹果PGIP的性质鉴定

3.3.1苹果PGIP的活力测定

3.3.2苹果PGIP的分子量测定

3.4苹果PGIP对苹果褐腐菌(Monilinia fructigena)的抑制作用

3.4.1苹果PGIP对苹果褐腐菌(Monilinia fructigena)PG的抑制作用

3.4.2 PGIP对苹果褐腐菌(Monilinia fructigena)生长的影响

第四章讨论与结论

4.1讨论

4.1.1苹果PGIP的分离纯化

4.1.2苹果PGIP对苹果褐腐菌(Monilinia fructigena)的抑制作用

4.2结论

4.2.1建立了苹果PGIP的提取与纯化方法

4.2.2首次通过实验证实了苹果PGIP对苹果褐腐菌PG和苹果褐腐菌生长的抑制作用

参考文献

附录：

致 谢

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