一种桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因及其克隆方法和应用

摘要

本发明公开了一种桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因及其克隆方法和应用，特点是桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，克隆方法包括如下步骤：（1）提取桃果实总RNA并反转录成cDNA作为模板；（2）根据PpPGIP1的基因序列设计引物；（3）PCR扩增：通过PCR扩增得到PpPGIP1基因扩增产物，优点是PpPGIP1和PpVIN2存在蛋白互作关系，在桃果实中有效抑制PpPGIP1表达量，可显著降低酸性转化酶PpVIN2活性，降低蔗糖分解。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，尤其是涉及一种调控桃果实酸性转化酶PpVIN2的桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因及其克隆方法和应用。

背景技术

桃(

酵母双杂交系统（Y2H）是将待研究的两种蛋白质分别克隆（融合）到，酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域（DNA-BD）和转录激活域（AD）上，构建成融合表达载体，根据表达产物和显色反应分析两种蛋白质相互作用的系统。通过酵母双杂交系统可有效筛选出PpVIN2的互作蛋白。

瞬时表达（transient expression）是指将目标基因通过特定的植物表达载体导入到植物活体内，在短时间内（可长达数天）表达，能够准确反应基因的功能，在启动子分析、蛋白互作和基因功能分析等方面用途广泛。病毒诱导的基因沉默（virus induced genesilencing，VIGS）是指携带目标基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源基因沉默、引起表型变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。农杆菌转化法具有简单快速、表达水平高和安全有效等特点。目前尚未有在桃果实中瞬时沉默PpPGIP1的成功应用，因此通过农杆菌转化法在桃果实中瞬时沉默目标基因PpPGIP1，对其基因功能分析和应用尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种正调控桃果实酸性转化酶PpVIN2，参与蔗糖代谢的桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因及其克隆方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

上述桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

上述桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因的克隆方法，包括如下步骤：

（1）提取桃果实总RNA并反转录成cDNA作为模板；

（2）根据PpPGIP1基因序列设计引物：上游引物序列：5´-CCCGCAATCACATTTCTTATCC-3´，下游引物序列：5´-CACTCCCAAGCTGCAAATAA-3´；

（3）PCR扩增：通过PCR扩增得到PpPGIP1基因扩增产物。

上述桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因在制备桃果实抗冻剂方面的应用。

上述桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因在制备桃果实酸性转化酶PpVIN2抑制剂方面的应用。

上述桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因在制备桃果实酸性转化酶PpVIN2抑制剂方面的应用，其特征在于：通过农杆菌瞬时转化法在桃果实中构建病毒诱导的桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因沉默系统，获得酸性转化酶VIN活性有效抑制的桃果实。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、首次证实了桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1，能够与酸性转化酶PpVIN2结合，并正调控其活性，影响蔗糖的分解代谢。

2、首次在桃果实中成功构建病毒诱导的基因沉默（VIGS）PpPGIP1系统，对于有效降低PpPGIP1表达量的“玉露”桃果实，可有效抑制酸性转化酶VIN活性，降低蔗糖的分解，维持蔗糖作为抗冻保护剂和调节渗透压的能力，从而使果实具有较高的耐冷性，减轻贮运过程中的冷害。

综上所述，本发明一个调控桃果实酸性转化酶PpVIN2的关键基因

附图说明

图1为Y2H系统证实PpPGIP1和PpVIN2存在蛋白-蛋白互作。注：阳性对照组；BD-53+AD-T；阴性对照组；BD-Lam+AD-T；实验组：BD-PpVIN2+AD-PpPGIP1；

图2为通过农杆菌瞬时转化法在桃果实内沉默PpPGIP1（A，B，C）抑制VIN酶活。注：（A）农杆菌侵染后的桃果实表型，（B）农杆菌瞬时转化后的PpPGIP1表达量分析，（C）农杆菌瞬时转化成功后对VIN活性的作用。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因克隆与序列分析

1、从“玉露”桃果实中提取总RNA，并反转成cDNA，用于PCR模板；具体如下：采用TIANGEN的RNA prep Pure Plant Kit (Tiangen, Beijing, China)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，提取桃果实总RNA，接着采用HiScript® II Q Select RT Super Mix for qPCR(Vazyme, Nanjing, China) 试剂盒反转录成cDNA作为PCR反应的模板；

2、使用在线网站NCBI-PRIMER（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/）设计桃果实PpPGIP1基因（Gene ID：LOC18769194）CDS区的特异性扩增引物，上游引物序列：5´-CCCGCAATCACATTTCTTATCC-3´，下游引物序列：5´-CACTCCCAAGCTGCAAATAA-3´；

3、PCR扩增：通过PCR扩增得到PpPGIP1基因扩增产物，PCR扩增的反应体系为：2 µLcDNA，12.5 µL 2×Phanta Max Master Mix（PCR扩增高保真酶：2×Phanta Max MasterMix购自南京诺唯赞生物科技有限公司），上、下游引物各1 µL，8.5 µL ddH2O；PCR 扩增程序为：预变性95 ℃ 3min；变性95 ℃ 15s，退火60 ℃ 15s，延伸，72 ℃ 1min，35个循环；彻底延伸72 ℃ 5min；

4、菌落PCR及测序比对：将PCR扩增产物回收纯化之后连接PMD18-T载体，转大肠杆菌DH5α后，涂布已均匀涂布X-Gal、IPTG的LB-Amp平板上，37 ℃倒置培养过夜；经PCR进一步验证后测序，获得与桃果实基因组数据相匹配的

ATGGACGTCAAGTTCCCCACCCTCCTCTGCTTGACCCTACTCTTCTCCACCATCCTAAACCAAGCGCTCTCCGAGCTCTGCAACCCGGAAGACAAGAAAGTTCTCCTACAAATCAAGAAAGCCTTCAACGACCCCTACGTCTTGACCTCATGGAAGCCAGAGACAGACTGCTGTGACTGGTACTGTGTCACCTGTGACTCCACCACAAACCGCATCAACTCCCTCACCATCTTCTCTGGCCAAGTCTCCGGTCAAATTCCGACCCAAGTCGGTGACTTGCCGTATCTTGAAACACTTGAGTTTCACAAGCAACCCAATCTTACCGGACCAATACAACCCTCCATTGCCAAGCTTAAGCGCCTCAAGGAGCTGCGCCTCAGCTGGACTAACATCTCAGGCTCTGTACCTGACTTCCTCAGCCAACTCAAGAACCTCACCTTTCTTGACCTCTCATTCAGTAACCTCACAGGCTCCATCCCCAGCTCGCTTTCTCAGCTTCCCAACCTCAACGCTCTTCATCTAGACCGTAACAAGCTCACAGGTCATATTCCGAAGTCATTTGGAGAATTCCATGGCAGTGTTCCAGAGCTCTATCTCTCCCACAACCAGCTCTCAGGCAACATACCAACCTCATTAGCCAAACTGGACTTCAACCGCATAGACTTCTCCCGGAACAAGCTCGAAGGCGATGCATCCATGATCTTTGGATTGAACAAGACAACCCAGATTGTGGATCTGTCTAGGAACTTGCTGGAATTTAATCTGTCAAAGGTGGAGTTTTCCAAGAGCTTGATATCGTTGGATCTTAACCATAACAAGATCACAGGCGGAATTCCGGTGGGGCTGACCCAAGTGGATTTGCAGTTCCTGAACGTGAGCTACAACAGGTTGTGTGGTCAGATTCCAGTGGGCGGGAAGTTACAGAGCTTCGACTCCTCAACTTATTTCCATAACCGCTGCTTGTGTGGTGCTCCACTCCCAAGCTGCAAATAA。

桃果实酸性转化酶抑制基因PpPGIP1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示：

MDVKFPTLLCLTLLFSTILNQALSELCNPEDKKVLLQIKKAFNDPYVLTSWKPETDCCDWYCVTCDSTTNRINSLTIFSGQVSGQIPTQVGDLPYLETLEFHKQPNLTGPIQPSIAKLKRLKELRLSWTNISGSVPDFLSQLKNLTFLDLSFSNLTGSIPSSLSQLPNLNALHLDRNKLTGHIPKSFGEFHGSVPELYLSHNQLSGNIPTSLAKLDFNRIDFSRNKLEGDASMIFGLNKTTQIVDLSRNLLEFNLSKVEFSKSLISLDLNHNKITGGIPVGLTQVDLQFLNVSYNRLCGQIPVGGKLQSFDSSTYFHNRCLCGAPLPSCK。

生物信息学分析表明PpPGIP1含330个氨基酸残基（AA），分子量为36.5 kDa，理论等电点（pI）为8.03。蛋白二级结构预测，PpPGIP1中α-螺旋占32.73 %，β-折叠占11.52 %，夹杂在α螺旋和片层结构之间的无规则卷曲占55.76 %。PpPGIP1多肽链的大部分AA残基均处于0值以下，整个肽链表现为亲水性，推测PpPGIP1为亲水性蛋白。PpPGIP1不存在跨膜区，1-330AA都在细胞膜表面，推测是外膜蛋白。蛋白信号肽预测表明，PpPGIP1在N端有24个AA信号肽序列，切割位点位于第24的丝氨酸Ser和第25的谷氨酸Glu之间。PpPGIP1含有7个N-糖基化位点，分别位于106,130,144,154,238,254,291处AA。PpPGIP1含有12个磷酸化位点，9个Ser位点，3个Thr位点。蛋白三级结构预测表明：PpPGIP1蛋白在N端和C端均有4个严格保守的半胱氨酸残基，中心区域由富含亮氨酸重复序列的LRR结构域占据。

具体实施例二

利用酵母双杂交系统（Y2H）证实PpPGIP1和PpVIN2存在蛋白-蛋白互作

1、构建与鉴定诱饵重组载体pGBKT7-PpVIN2和猎物重组载体pGADT7-PpPGIP1

使用在线网站NCBI-PRIMER（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/）设计桃果实PpPGIP1基因和PpVIN2基因（Gene ID分别为LOC18769194、LOC18776102）的特异性扩增引物，引物两端分别带有合适的酶切位点和表达载体的同源序列（表1）。引物的标准按照同源重组酶Clon Express ®II One Step Cloning Kit（Vazyme, Nanjing, China）和高保真酶2×Phanta Max Master Mix（Vazyme, Nanjing,China）的要求，在目的片段正反向特异性引物的5’端引入线性化载体两末端同源序列，使扩增后的目的片段5’和3’最末端分别带有线性化表达载体两末端对应一致的同源序列（15-20 bp），保证了目的片段插入表达载体的方向。

表1 构建重组载体pGADT7-PpPGIP1和pGBKT7-PpVIN2的引物序列

注：下划线表示载体的同源序列；加粗表示酶切位点，依次为BamHI、PStI、BamHI、XhoI

PCR扩增的反应体系均为25 μL：2µL cDNA，12.5 µL 2×Phanta Max Master Mix，上、下游引物各1 µL，8.5 µL ddH2O。目的片段PpPGIP1的PCR扩增程序为95 ℃预变性3min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，（35个循环数）；72 ℃彻底延伸5min。目的片段PpVIN2的PCR扩增程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15s，72 ℃延伸2 min30 s，（35个循环数）；72 ℃彻底延伸5 min。

依照Clon Express

根据DH5α Competent Cell（CWBIO, Beijing, China）的要求，用热击法将重组子AD-PpPGIP1和BD-PpVIN2分别转大肠杆菌DH5α后，涂布已均匀涂布X-Gal、IPTG的LB-Amp/kana平板上，37 ℃倒置培养过夜，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，挑取含有目的片段的阳性克隆送往上海生物工程有限公司测序。确保无误后扩繁保存菌液并抽提质粒，分别得到猎物重组质粒AD-PpPGIP1和诱饵重组质粒BD-PpVIN2。

2、诱饵质粒毒性和自激活的检测

诱饵质粒毒性检测：将诱饵质粒pGBKT7-PpVIN2和空载体pGBKT7分别转化到Y2HGold酵母感受态细胞，分别涂布SD/-Trp缺陷型培养基，在30 ℃恒温培养箱倒置培养3-5天，观察平板上的菌落生长状态。

诱饵质粒自激活检测：将诱饵质粒pGBKT7-PpVIN2 和空载体pGADT7共转化到Y2HGold酵母感受态细胞，所得转化产物分别涂SD/-Trp/-Leu；SD/-Trp/-Leu/-His；SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培养基，在30 ℃恒温培养箱倒置培养3-5天，观察平板上的菌落生长状态。

3、重组质粒共转化及互作蛋白融合子的鉴定

根据醋酸锂（LiAc）转化方法，将诱饵和猎物载体与热变性的鲑鱼精DNA（carrierDNA）一起共转化到酵母菌株Y2H Gold（Yeastmaker

结果如图1所示，表明将诱饵载体BD-PpVIN2+猎物载体AD-PpPGIP1，BD-53 + AD-T和BD-Lam + AD-T共转化酵母细胞，均能在营养缺陷型平板DDO中正常生长，说明融合蛋白成功转入酵母细胞Y2H Gold中。并且，实验组BD-PpVIN2+AD-PpPGIP1和阳性对照组BD-53+AD-T共转染的酵母菌株均可在QDO板上正常生长，共转化子均在QDO-X-A平板中显蓝。阴性对照组BD-Lam + AD-T的酵母菌株的阴性对照不能在QDO培养基中正常生长，呈锈红死菌状，且无法在QDO-X-A培养基中显蓝。结果表明，PpPGIP1与PpVIN2通过蛋白-蛋白相互作用激活了酵母基因组中的ADE2，HIS3和MEL1报告基因。该结果证实了猎物蛋白PpPGIP1和诱饵蛋白PpVIN2之间存在蛋白-蛋白互作。

具体实施例三

通过农杆菌瞬时转化法和病毒诱导的基因沉默（VIGS）在桃果实中沉默PpPGIP1，显著抑制VIN活性

供试品种“玉露”水蜜桃（Prunus persica L. Batsch）摘自浙江省宁波市奉化水蜜桃研究所，挑选大小均匀，无病虫伤害和机械性损伤的绿熟期桃果实，用于农杆菌侵染。

1、为了提高沉默效率，并减少非目标基因被沉默的可能性，利用在线软件SGNVIGS（https://vigs.solgenomics.net/），针对PpPGIP1（Gene ID：LOC18769194），将预测得到目标基因

重组载体pTRV2-PpPGIP1的构建与鉴定：使用在线网站NCBI-PRIMER（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/）设计桃果实PpPGIP1（Gene ID:LOC18769194）的特异性扩增引物，引物两端分别带有合适的酶切位点和表达载体的同源序列（表2）。

表2 构建重组载体pTRV2-PpPGIP1的引物序列

注：下划线表示载体的同源序列；加粗表示酶切位点，依次为XbaI和SmaI.

PCR扩增的反应体系均为25 μL：1µL cDNA，12.5 µL 2×Taq Master Mix，上、下游引物各1 µL，9.5 µL ddH2O。目的片段PGIP的PCR扩增程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，（35个循环数）；72 ℃彻底延伸5 min。

依照Clon Express®II重组反应体系，根据载体和目的片段的回收产物的浓度，计算重组反应中各组分用量，完成重组反应。将PpPGIP1连接表达载体pTRV2，重组载体命名为pTRV2-PpPGIP1。

根据DH5α Competent Cell（CWBIO, Beijing, China）的要求，用热击法将连接液pTRV2-PGIP分别转E.coli DH5α后，涂布已均匀涂布X-Gal、IPTG的LB /kana平板上，37 ℃倒置培养过夜，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定。挑取含有目的片段的阳性克隆送往上海生物工程有限公司测序。获得与桃果实基因组数据相匹配的PpPGIP1特异性沉默序列（300bp）如下所示：

GACCCCTACGTCTTGGCCTCATGGGACCCAGAGACAGACTGCTGTGACTGGTACTCTGTCACCTGTGACTCCACCACAAACCGCGTCAACTCCCTCACCCTCTTCTCCGGGGGACTCTCCGGTCAAATTCCGACCCAAGTCGGTGACTTGCCGTATCTTGAAACACTTGAGTTTCACAAGCAACCCAATCTTACCGGACCAATCCAACCCTCCATTGCCAAGCTTAAGCGCCTCAAGGAGCTGCGCCTCAGCTGGACCAACATCTCCGGCTCTGTCCCTGACTTCCTCAGCCAACTCAAG。

2、重组质粒转化农杆菌，侵染桃果实

通过冻融法将携带靶基因片段的重组质粒和空载，分别转化到根癌农杆菌GV3101中。在LB固体培养基（kan，50 μg/mL；Gen，50 μg/mL；rif，50 μg/mL）28 ℃培养2-3天，挑取单克隆接种至新鲜LB液体培养基（kan，50 μg/mL；Gen，50 μg/mL；rif，50 μg/mL）28 ℃活化12-16 h，分别于新鲜LB液体培养基（kan，50 μg/mL；rif，50 μg/mL；MES，10mM；AS，40mM）中，28 ℃，200 rpm 摇床培养16-24 h至OD600=0.8-1.0。经室温，5000 g，10 min离心收集菌体，弃上清液。将其重悬于渗透缓冲液（10 mM MgCl2；10 mM MES，pH5.6；200μM AS）中，将OD600调节至1.0，然后将重悬缓冲液在黑暗中静置3小时。

分别用无菌注射器将重悬缓冲液注射到“玉露”桃果实阴阳两面，针头约在果皮下1 cm处，不触及到桃核，侵染后的桃果实贮藏于20 ℃，湿度85 %-90 %。一组桃果实注射GV3101-pTRV1和GV3101-pTRV2-PpPGIP1体积比1:1的重悬液，另一组桃果实注射GV3101-pTRV1和GV3101-pTRV2体积比1:1的重悬液，所有桃果实分别在侵染后7,10天取样，存于-80℃。

3、农杆菌瞬时转化后的桃果实表型及PpPGIP1基本表达量的分析

结果如图2所示，表明在农杆菌侵染后第10天的桃果实，在桃果实表面能直观显示侵染区域颜色加深，呈青绿色，将果皮削掉后发现未侵染区域为正常桃果实色泽，呈白色，注射侵染区域呈淡绿色。qPCR分析表明，侵染后在20 ℃贮存第7天和第10天，GV3101-pTRV1+pTRV2-PpPGIP1组中PpPGIP1的表达水平显著低于对照组GV3101-pTRV1+pTRV2。PpPGIP1基因的表达水平比对照组降低了10 %，34 %，表明桃果实中的PpPGIP1基因有效沉默，通过农杆菌瞬时转化法在桃果实中沉默PpPGIP1的系统成功构建。

4、农杆菌瞬时沉默PpPGIP1的桃果实中VIN活性分析

如图2所示，相对于对照组，沉默PpPGIP1的实验组中VIN酶活在第7天和第10天分别下降10 %、34 %，表明在桃果实中有效抑制PpPGIP1可以显著降低VIN酶活。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序 列 表

<110> 宁波大学

<120> 一种桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因及其克隆方法和应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 993

<212> DNA

<213> 桃果实酸性转化酶抑制基因全长（ATGGACGTCAAGTTCCCCACCCTCCTCTGCTTGACCCTACTCTTCTCCACCATCCTAAACCAAGCGCTCTCCGAGCTCTGCAACCCGGAAGACAAGAAAGTTCTCCTACAAATCAAGAAAGCCTTCAACGACCCCTACGTCTTGACCTCATGGAAGCCAGAGACAGACTGCTGTGACTGGTACTGTGTCACCTGTGACTCCACCACAAACCGCATCAACTCCCTCACCATCTTCTCTGGCCAAGTCTCCGGTCAAATTCCGACCCAAGTCGGTGACTTGCCGTATCTTGAAACACTTGAGTTTCACAAGCAACCCAATCTTACCGGACCAATACAACCCTCCATTGCCAAGCTTAAGCGCCTCAAGGAGCTGCGCCTCAGCTGGACTAACATCTCAGGCTCTGTACCTGACTTCCTCAGCCAACTCAAGAACCTCACCTTTCTTGACCTCTCATTCAGTAACCTCACAGGCTCCATCCCCAGCTCGCTTTCTCAGCTTCCCAACCTCAACGCTCTTCATCTAGACCGTAACAAGCTCACAGGTCATATTCCGAAGTCATTTGGAGAATTCCATGGCAGTGTTCCAGAGCTCTATCTCTCCCACAACCAGCTCTCAGGCAACATACCAACCTCATTAGCCAAACTGGACTTCAACCGCATAGACTTCTCCCGGAACAAGCTCGAAGGCGATGCATCCATGATCTTTGGATTGAACAAGACAACCCAGATTGTGGATCTGTCTAGGAACTTGCTGGAATTTAATCTGTCAAAGGTGGAGTTTTCCAAGAGCTTGATATCGTTGGATCTTAACCATAACAAGATCACAGGCGGAATTCCGGTGGGGCTGACCCAAGTGGATTTGCAGTTCCTGAACGTGAGCTACAACAGGTTGTGTGGTCAGATTCCAGTGGGCGGGAAGTTACAGAGCTTCGACTCCTCAACTTATTTCCATAACCGCTGCTTGTGTGGTGCTCCACTCCCAAGCTGCAAATAA）

<400> 1

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213>桃果实酸性转化酶抑制基因编码蛋白（MDVKFPTLLCLTLLFSTILNQALSELCNPEDKKVLLQIKKAFNDPYVLTSWKPETDCCDWYCVTCDSTTNRINSLTIFSGQVSGQIPTQVGDLPYLETLEFHKQPNLTGPIQPSIAKLKRLKELRLSWTNISGSVPDFLSQLKNLTFLDLSFSNLTGSIPSSLSQLPNLNALHLDRNKLTGHIPKSFGEFHGSVPELYLSHNQLSGNIPTSLAKLDFNRIDFSRNKLEGDASMIFGLNKTTQIVDLSRNLLEFNLSKVEFSKSLISLDLNHNKITGGIPVGLTQVDLQFLNVSYNRLCGQIPVGGKLQSFDSSTYFHNRCLCGAPLPSCK）

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> PpPGIP1基因上游引物序列（5′-CCCGCAATCACATTTCTTATCC-3′）

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> PpPGIP1基因下游引物序列（5′-CACTCCCAAGCTGCAAATAA-3′）

<400> 4

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213>pGBKT7-PpVIN2-F（AGGCCGAATTCCCGG GGATCC ATGGCAGACCCAAGACCTTTTCTTC）

<400> 5

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213>pGBKT7-PpVIN2-R（CTAGTTATGCGGCCG CTGCAG CATGAACGAAATCGAAATCG）

<400> 6

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> pGADT7-PpPGIP1-F（GTGGGCATCGATACG GGATCC CCCGCAATCACATTTCTTATCC）

<400> 7

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> pGADT7-PpPGIP1-R（ACGATTCATCTGCAG CTCGAG TTATTTGCAGCTTGGGAGTG）

<400> 8

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> pTRV2-PpPGIP1-F（AAGGTTACCGAATTC TCTAGA GACCCCTACGTCTTGGCCTC）

<400> 9

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> pTRV2-PpPGIP1-R（TGTCTTCGGGACATG CCCGGG CTTGAGTTGGCTGAGGAAGTCAG）

<400> 10

<210> 11

<211> 300

<212> DNA

<213> PpPGIP1特异性沉默序列（GACCCCTACGTCTTGGCCTCATGGGACCCAGAGACAGACTGCTGTGACTGGTACTCTGTCACCTGTGACTCCACCACAAACCGCGTCAACTCCCTCACCCTCTTCTCCGGGGGACTCTCCGGTCAAATTCCGACCCAAGTCGGTGACTTGCCGTATCTTGAAACACTTGAGTTTCACAAGCAACCCAATCTTACCGGACCAATCCAACCCTCCATTGCCAAGCTTAAGCGCCTCAAGGAGCTGCGCCTCAGCTGGACCAACATCTCCGGCTCTGTCCCTGACTTCCTCAGCCAACTCAAG）

<400> 11